SNT 2732-2010 牛瘟检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#!!$%$牛瘟检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’’*(1+’,+2)!$%$3%%3$%发布!$%%3$&3$%实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准依据!!#$%$&’’(给出的规则起草#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位$中华人民共和国云南出入境检验检疫局%中华人民共和国新疆出入境检验检疫局%中华人民共和国吉林出入境检验检疫局%中华人民共和国深圳出入境检验检疫局#本标准主要起草人$周晓黎%严树发%季新成%王振国%杨建明%花群义%叶玲玲%艾军#!!!#!#!!$%$牛瘟检疫技术规范%!范围本标准规定了牛瘟病毒的分离及鉴定%聚合酶链和酶联免疫吸附试验检测方法#本标准适用于牛及其他反刍动物牛瘟的诊断和流行病学调查#!!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件&仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件&其最新版本’包括所有的修改单(适用于本文件#!!#$)’))!出入境动物检疫采样#!疫病简介牛瘟是由牛瘟病毒引起&牛的急性%高度接触传染性%病毒性疾病&以突然发病%高热%粘膜发炎坏死%病程短%死亡率高为主要特征#可引起牛%绵羊%山羊等反刍动物发病&猪可感染和传播本病’参见附录*(#&!现场检验检疫逐头进行临床检查&根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断#’!采样按!!#$)’))规定&逐头进行采样&并按规定填写)送样单*送实验室#(!诊断方法(%%!总则用分子生物学%血清学等方法可以对牛瘟作出初步诊断&而要确诊应进行病毒分离鉴定&特别是首次发生地区的病例#此外&对流行的牛瘟病毒的致病性%毒力及抗原性进行分析时&病毒分离鉴定也是最可靠的方法’病毒的分离及鉴定需在生物安全三级实验室进行(#(%!!病毒分离及鉴定(%!%%!材料和试剂(%!%%%%!毒株$采用冻干适应细胞培养的牛瘟鸡胚化弱毒株或牛瘟+,-./.+’,疫苗株#(%!%%%!!标准血清$牛瘟标准阳性血清%阴性血清#(%!%%%#!细胞$犊牛原代肾细胞或(0,狨猴类淋巴母细胞或非洲绿猴肾细胞’1.23(#$!!#!#!!$%$(%!%%%&!细胞培养液%维持液%分散液配制见附录#(%!%%%’!无牛瘟病毒抗体犊牛血清’0456’789灭能(#(%!%!!仪器和设备(%!%!%%!乳钵或组织捣碎器%镊子%剪刀%冰箱#(%!%!%!!&:%(4孔细胞培养板%微量移液器%滴头%二氧化碳培养箱%倒置显微镜#(%!%#!样品的采集及处理(%!%#%%!样品的采集用肝素或乙二胺四乙酸二钠’终浓度分别为$’;!7=和’%07!7=(抗凝采集全血&充分混匀后&装冰盒’不冰结(送往实验室&分离出白血球进行牛瘟病毒分离#也可用死亡动物的脾脏%肩前或肠系膜淋巴结等样品’可冻结保存运输(进行病毒分离#(%!%#%!!样品处理(%!%#%!%%!血液$0’’’2!789离心抗凝血$0789&在血浆和红血球之间获得棕黄层&无菌取出&加入&’7=无菌生理盐水&洗涤离心&除去血浆中的所有中和抗体#用维持液重悬细胞沉淀物&接种敏感细胞#(%!%#%!%!!组织$将样品剪碎用无血清培养液制成&’?悬液&内含&’’;!7=青霉素和链霉素&&%0!7=两性霉素&置乳钵或组织捣碎器研磨&经&’’’2!789离心&’789&取上清液置@A’5保存备用#(%!%&!接种敏感细胞(%!%&%%!按常规方法制备犊牛原代肾细胞%(0,狨猴类淋巴母细胞%非洲绿猴肾细胞’1.23(#(%!%&%!!将制成的样品悬液接种长成单层的上述敏感细胞&每份病料接种两孔&每孔接种$7=&置6A5吸附$B&细胞维持液洗涤&次&加细胞维持液$7=&至6A50?二氧化碳培养箱中培养#观察细胞病变’CDE(形成情况#典型的病变是细朐变圆%萎缩%胞质间桥伸长’星状细胞(或形成合胞体#CDE形成的速度随病毒株的不同有所变化#(%!%&%#!培养$$F&若无CDE出现&则盲传两代&无CDE出现判为阴性&出现CDE则需进一步鉴定#(%!%’!病毒鉴定(%!%’%%!病毒中和试验(%!%’%%%%!病毒收获$收获出现CDE的病毒悬液&重新复壮&待CDE达A0?时&收获冻融&次#6次或经超声波处理&&’’’2!789离心&’789&取上清液&分装置@A’5保存备用#(%!%’%%%!!中和$将分离的病毒液在(4孔板上用无血清维持液作$’倍系列稀释’$’@$#$’@0(&每个稀释度:孔&每孔0’=&在其中两孔中加入等量的牛瘟标准阳性血清&另外两孔加入等量牛瘟标准阴性血清&6A5作用$B&每孔加入$’’=继代犊牛肾细胞或1.23细胞’&G$’0!7=(悬液&置6A5&0?二氧化碳培养箱培养$$F#从第二天开始&每天观察#(%!%’%%%#!结果判定$如果阴性血清组#C;H0’达到$’6#$’0&牛瘟阳性血清中和组病毒被完全中和不出现细胞病变或0’?以上细胞不出现CDE&则判为牛瘟阳性#(%!%’%!!其他鉴定方法可用免疫荧光试验%琼脂扩散试验%电镜检查%接种试验动物等方法进行鉴定#&!!#!#!!$%$(%#!琼脂凝胶免疫扩散试验’$%&’((%#%%!材料和试剂(%#%%%%!抗原$用牛瘟病毒感染细胞或阳性感染公牛肠系膜淋巴结浸渍制备#(%#%%%!!牛瘟阳性血清$兔抗牛瘟高免血清#(%#%%%#!琼脂糖%氯化钠%叠氮钠#(%#%!!器械和设备平皿%微量移液器%打孔器%微量滴头%三角烧瓶#(%#%#!操作步骤(%#%#%%!琼脂凝胶平板的制备称取琼脂糖$%’&氯化钠’%)0&加水至$’’7=&经煮沸溶解后&冷却至:05&加入’%’$叠氮钠#每个平皿加融化琼脂&使琼脂板厚度约为:77&待凝固后倒置:5冰箱保存备用#(%#%#%!!待检抗原制备用送检的淋巴结切面渗出液制备&如无渗出液&可取小块样品研磨#眼分泌物可直接用棉拭子或将拭子放注射器针管内挤压取得#(%#%#%#!打孔中间$孔&周围4孔为一组#孔径:77&孔间距677#用针挑出或吸出孔内琼脂&用温水或火焰封底#(%#%#%&!加样按图$&中心孔加兔抗牛瘟高免血清&$%6%0孔加阳性抗原对照-阴性对照抗原加第:孔-待检样品加第&%4孔#加样量以孔平为准#加样后静置$’789&移入湿盒内于室温’&&5#&05(反应#图%!琼扩加样示意图(%#%&!判定(%#%&%%!结果判定$&:B初判&A&B终判#在阳性抗原孔与中央阳性血清孔之间形成沉淀线的前提下进行判定#(%#%&%!!阳性$被检抗原孔与阳性血清孔之间出现致密的沉淀线&并与标准阳性对照抗原的沉淀线末端呈平滑相连者#(%#%&%#!阴性$被检抗原孔与阳性血清孔之间不出现沉淀线#6!!#!#!!$%$(%&!聚合酶链反应’(#)*+(((%&%%!试剂和材料(%&%%%%!反转录试剂$*I1反转录酶’$6!=(%HJ#DK’每种浓度均为$’773L!=(%MJ*K89’:’!=(%!#HJ*聚合酶’0!=(%反转录缓冲液%DCM缓冲液#(%&%%%!!引物’&0N73L!=($根据牛瘟病毒O蛋白基因的保守序列设计&其序列和扩增产物见表$#表%!引物序列序号引!!物扩增产物O$0.!!!*C*!#!C##C*!CC#*##**!!6.M$0.C*!CCC#*!C##C#!*CCC*C!*#*6.6A&O&0.!C#C#!**C!C#*##*C#**!6.M&0.C#!C##!#C!#*###CC#C**6.&60(%&%%%#!随机引物’4核苷酸((%&%%%&!HEDC水按’%$?加入HEDC&摇匀&室温静置过夜&$%’$G$’0D,高压&’789&冷却备用#(%&%%%’!HJ*I,2P.2H=&’’’分子量标准#(%&%%%(!其他试剂$无水乙醇%氯化镁’&0773L!=(异丙醇%三氯甲烷%乙二胺焦碳酸’HEDC(%电泳缓冲液’#*E(%溴化乙锭’$’7!7=(%琼脂糖’电泳级(&4G载样缓冲液#(%&%%%!$%07=%’%07=硅化离心管%滴头$在含有’%$?HEDC的去离子水中过夜&$%’$G$’0D,高压$0789&:’5烘干备用#(%&%!!设备低温高速离心机%微量高速离心机%水浴锅’’5#$’’5(%旋涡振荡器%超声波捣碎仪%扩增仪%凝胶电泳仪%水平电泳槽%凝胶紫外检测仪%超净工作台%微量移液器#(%&%#!样品处理(%&%#%%!组织%淋巴结和扁桃体%齿龈刮取物和眼拭子或眼和口腔坏死拭子的处理$绞碎%研磨或用:’*的超声波$789打碎&制成匀浆&0’’’2!789离心$’789&取上清液备用#(%&%#%!!阳性对照样品的制备将牛瘟病毒按$’?接种敏感细胞&于6A5吸附$B后加入维持液&6A50?二氧化碳培养箱中培养&待CDE达A0?时收获病毒悬液-冻融&次#6次&0’’’2!789离心$’789&取上清液备用#(%&%#%#!阴性对照样品的制备将生长良好的敏感细胞&冻融$次#&次&0’’’2!789离心$’789&取上清液备用#(%&%&!($的提取’若使用($提取试剂盒&则参照说明书进行((%&%&%%!在样品处理区进行’除本标准规定的方法外&也可采用其他等效的MJ*提取方法&具体操作见有关试剂说明书(#所有MJ*提取器皿用HEDC水浸泡&:B&灭菌后方可使用#(%&%&%!!取$个$%07=灭菌离心管&其中$为待检样品数%一管阳性对照及一管阴性对照之和&对每管进行编号标记#(%&%&%#!每管加入A0’=#28Q3L&然后分别加入待检样品%阳性对照和阴性对照各&0’=&混匀&静置0789-再加入&’’=三氯甲烷&混均&静置0789&于:5条件下&$&’’’2!789离心$0789#:!!#!#!!$%$(%&%&%&!取相同数量的$%07=灭菌离心管&加入0’’=异丙醇’@&’5预冷(&对各个管进行对应编号#吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中&上清液约吸取0’’=’注意不要吸出中间白色絮状层(&颠倒混匀#(%&%&%’!于:5条件下&$&’’’2!789离心$0789#取出离心管&轻轻倒去上清液&加入$7=A0?乙醇&颠倒洗涤#(%&%&%(!于:5条件下&$&’’’2!789离心$0789#取出离心管&轻轻倒去上清液&倒置于吸水纸上&吸干液体&不同样品应在吸水纸不同地方吸干#(%&%&%!每管加入&’=灭菌HEDC水&轻轻混均&溶解管壁上的MJ*&&’’’2!789离心0K&冰上保存备用#提取的MJ*应在&B内进行M#RDCM扩增或放置于@A’5冰箱备用#(%&%’!反转录合成,’$(%&%’%%!MJ*的变性$在离心管中依次加入$随机引物’J4(&&=-提取的MJ*&A=-HEDC水&0=#轻微振荡&瞬时离心-A’5$’789&冰浴&789#瞬时离心#(%&%’%!!反转录$于4%:%0%$离心管中依次加入$0G反转录酶缓冲液&:=-FJ#DK&$=-MJ,K89&’%0=-*I1反转录酶&’%0=#瞬时离心&:&54’789-A’5$0789-冰浴6789&瞬时离心&立即进行DCM扩增或@&’5保存备用#(%&%(!*+(扩增(%&%(%%!取’%07=离心管&作好标记&依次在超净台内加入$$’GDCM缓冲液0=&氯化镁6=&FJ#DK$=&!#HJ*酶’%0=&引物O$$=&引物M$$=&SHJ*:=&HEDC水&6:%0=#(%&%(%!!置DCM仪内&(05!0789-(:5!$789&0’5!$789&A&5!&789&6’个循环-A&5!$’789&:5保存#(%&%!套式*+(扩增在反应混合物配置检测区进行#在DCM管中依次加入以下试剂$$’GDCM缓冲液0=&扩增产物$%0=&引物O&$=-引物M&$=&FJ#DK$=&!#HJ*酶’%0=&氯化镁6=&HEDC水&6A=#反应条件同4%:%4%&#(%&%)!*+(产物的检测(%&%)%%!$%0?琼脂糖凝胶的制备&见附录#(%&%)%!!加载样品$取扩