SNT 2701-2010 动物炭疽病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$!#$#动物炭疽病检疫规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’&(*1&/&()2’&3!#$#4$$4#$发布!#$$4#%4#$实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（２００８年）中第２．１．１章制定，未采纳其中的免疫荧光及疫苗制备技术内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王海艳、姜焱、刘虹、敖威华、刘中勇、季新成、刘中学、赵林立、张晓峰、任立新。Ⅰ犛犖／犜２７０１—２０１０动物炭疽病检疫规范１　范围本标准规定了动物炭疽病流行病学调查、临床症状与病理学观察、细菌学检测、Ａｓｃｏｌｉ反应和聚合酶链反应等检疫方法。本标准适用于进出境动物炭疽病的检疫和诊断。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＳＮ０３３１—１９９４　出口畜产品中炭疽杆菌检验方法３　生物安全炭疽为人畜共患病，试验环境和防护要求按照ＧＢ１９４８９执行。４　培养基和试剂４．１　无菌脱纤绵羊血（或马血）。４．２　炭疽沉淀素标准抗原。４．３　炭疽沉淀素阳性血清。４．４　炭疽沉淀素阴性血清。４．５　０．７％碳酸氢钠营养琼脂平板：见附录Ａ．１。４．６　多粘菌素血琼脂平板：见附录Ａ．２。４．７　普通营养肉汤：见附录Ａ．３。４．８　普通营养琼脂平板：见附录Ａ．４。４．９　戊烷脒多粘菌素琼脂平板：见附录Ａ．５。４．１０　ＰＬＥＴ琼脂平板：见附录Ａ．６。４．１１　碱性美蓝染色液：见附录Ａ．７。４．１２　革兰氏染色液：见附录Ａ．８。４．１３　洗样液：见附录Ａ．９。４．１４　０．５％石炭酸生理盐水：见附录Ａ．１０。４．１５　电泳级琼脂糖粉。４．１６　犜犪狇ＤＮＡ聚合酶：５Ｕ／μＬ。４．１７　１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ（脱氧核糖核酸分子量标准）。４．１８　１０倍浓度犜犪狇ＤＮＡ聚合酶缓冲液（１０×犜犪狇Ｂｕｆｆｅｒ）：１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。４．１９　ｄＮＴＰ混合物：脱氧腺苷三磷酸（ｄＡＴＰ）、脱氧胸苷三磷酸（ｄＴＴＰ）、脱氧鸟苷三磷酸（ｄＧＴＰ）、脱１犛犖／犜２７０１—２０１０氧胞苷三磷酸（ｄＣＴＰ）各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。４．２０　５０×ＴＡＥ电泳缓冲液：见附录Ａ．１１。４．２１　６×加样缓冲液：见附录Ａ．１２。４．２２　溴化乙锭溶液：见附录Ａ．１３。５　设备和材料５．１　恒温培养箱。５．２　二氧化碳培养箱。５．３　恒温水浴箱。５．４　生物显微镜。５．５　Ａｓｃｏｌｉ反应管（小试管，内直径约０．５ｃｍ左右）。５．６　高压灭菌器。５．７　微量加样器。５．８　高速冷冻离心机。５．９　ＰＣＲ仪。５．１０　水平凝胶电泳槽。５．１１　电泳仪。５．１２　凝胶成像系统。６　临床症状依据本病流行病学调查、临床症状和病理学观察结果初步作出判定，见附录Ｂ。７　实验室检测７．１　新鲜样品检测７．１．１　组织液涂片取活体动物耳部血液、病变部位的水肿液或渗出液制作涂片或取刚死亡动物末梢血制作涂片。自然干燥后，火焰固定，备用。７．１．２　血液琼脂平板培养取血液、水肿液、渗出物以及组织或器官切面上采集的拭子直接接种含有多粘菌素（１０００００ＩＵ／Ｌ）的５％～７％马血（或羊血）血平板表面，置３７℃培养１８ｈ～２４ｈ。在血液琼脂平板上，炭疽杆菌呈灰白色至灰色菌落，直径为０．３ｍｍ～０．５ｍｍ，不溶血，表面潮湿似毛玻璃样，不透明，无光泽，边缘不整齐。用放大镜观察，边缘呈卷发状。用接种环探触有粘滞感，挑之可拉起长丝。７．１．３　营养肉汤培养取血液琼脂平板上的典型菌落接种营养肉汤，于３７℃培养５ｈ～１２ｈ。炭疽杆菌在肉汤中生长的初期特征是肉汤上部澄清，无菌膜，下部有絮状沉淀，沉淀不易摇散。７．１．４　荚膜诱导培养取血液琼脂平板培养的典型菌落或营养肉汤培养物接种于含０．７％碳酸氢钠的营养琼脂平板，置２犛犖／犜２７０１—２０１０２０％二氧化碳培养箱中培养１８ｈ～２４ｈ，取菌落涂片，火焰固定，备用。７．１．５　染色镜检７．１．５．１　革兰氏染色取血液琼脂平板上的典型菌落或肉汤培养物制备涂片，火焰固定。结晶紫染色１ｍｉｎ，水洗，革兰氏碘液染色１ｍｉｎ，水洗，９５％酒精脱色３０ｓ，水洗，沙黄复染３０ｓ，水洗，干燥，镜检。炭疽杆菌为革兰氏阳性菌，多个菌纵向连成长链，少数散在，菌体呈两端平齐的大杆状。有的菌体中央可见卵圆形不着色的芽孢，芽孢不使菌体膨大。７．１．５．２　荚膜染色取已固定好的血液、水肿液或渗出液、荚膜诱导培养物涂片，滴加一小滴碱性美蓝染色液染色１ｍｉｎ，水洗、晾干、镜检。炭疽杆菌在低倍镜下呈短链状排列，在油镜下菌体粗大呈竹节状排列，菌体呈深蓝色或黑色，菌体周围的荚膜呈粉红色。７．２　陈旧、腐败脏器、动物尸体和环境样品（包括土壤）的检测采集样品２５ｇ左右，将其与两倍体积的灭菌蒸馏水或去离子水混合，于６３℃水浴１５ｍｉｎ。然后稀释至１０－２或１０－３。取每个稀释度的样品稀释液１００μＬ涂布于血琼脂平板，取２５０μＬ～３００μＬ涂布于ＰＬＥＴ琼脂平板，置３７℃温箱中培养。血琼脂平板培养１８ｈ～２４ｈ、ＰＬＥＴ琼脂平板培养２４ｈ～４８ｈ。挑取可疑菌落按７．１．３、７．１．４、７．１．５的方法进行鉴定。７．３　畜产品检测７．３．１　细菌学检测（按照犛犖０３３１—１９９４中第４章、第５章、６．１、６．２和６．３的内容执行）７．３．１．１　抽样毛绒和骨粒按生产日期或原料来源划分批次。每批按３０％开包（箱）抽样或在扎包（装箱）时由每包（箱）各取一份样品。无菌从每包（箱）的不同部位共抽样３ｇ～５ｇ，装进灭菌的棉布袋内，将袋口扎紧，作上批次标记。将样品装入塑料袋或铁筒内，密封后送样。动物皮张应逐张取样。用灭菌棉拭子涂擦样皮的真皮面。将棉拭子插入试管，塞紧棉塞。将试管逐支用纸包裹，装入铁筒内，再用棉花或软纸填充空隙，密封后送样。７．３．１．２　样品处理７．３．１．２．１　毛绒和骨粒，可以根据样品多少，将适合数量的同批样品（最多不超过１０份）合编为一个检验样品单位，作好记录。从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取１ｇ～２ｇ样品，一起放入一个适当大小的灭菌三角瓶中。加样品量３０倍～４０倍（质量浓度）的预冷洗样液于三角瓶中用灭菌瓶塞将瓶口塞严。将三角瓶冰水浴或０℃～４℃冰箱内，间或摇动约１ｈ。将瓶中洗样液倒入５００ｍＬ灭菌离心管中，盖住管口，以３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ。弃去上清液，加少许灭菌水，使沉淀均匀悬浮。将离心管静置５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，待杂质下沉后，将上悬液移入另一支灭菌试管内，于６５℃恒温水浴加热３０ｍｉｎ。　　加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验，应贮存于０℃～４℃冰箱内，以防芽孢发芽。７．３．１．２．２　动物皮张的棉拭子涂抹样品，如不能及时检验，应贮存于０℃～４℃冰箱内，以防芽孢发芽。３犛犖／犜２７０１—２０１０７．３．１．３　检验方法按７．３．１．２处理后的毛绒和骨粒样品悬液，根据每管所包括样品份数之多少，各接种１个～３个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。接种时用灭菌吸管吸取样品，滴加于平板表面，各０．１ｍＬ～０．３ｍＬ。如有剩余样品，可增接数个平板，直至将样品接种完。用灭菌Ｌ型玻璃棒将滴加的样液涂布均匀。如样液较多，可将平板置于３７℃温箱，微开皿盖，使样液迅速干燥。翻转平皿，置于３７℃恒温箱，培养４８ｈ～７２ｈ。挑取可疑菌落按照７．１．３、７．１．４、７．１．５的方法进行鉴定。动物皮张的棉拭子涂抹样品，将棉拭子由试管内取出，各涂抹一个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。翻转平皿，置于３７℃恒温箱，培养２４ｈ～４８ｈ。挑取可疑菌落按照７．１．３、７．１．４、７．１．５的方法进行鉴定。７．３．２　犃狊犮狅犾犻反应７．３．２．１　样品采集被检皮张、原毛应存放于专用仓库和指定的地方，不同批次的皮张、原毛分开存放。每批放在一处，每张皮张编号，原毛独立包装编号。在每张皮的腿部或腋下剪取样皮一块约２ｇ，原毛在各独立包装取样３ｇ，若无独立包装则在分散的２０个以上不同点各取样３ｇ。样皮、样毛应装入专用的密封金属盒或耐高温防水样品袋中，并按原有号码编号。７．３．２．２　样品消毒将检验样本连同样品袋一起放入高压灭菌器，１．０３４×１０５Ｐａ消毒３０ｍｉｎ。冻皮、湿皮、鲜皮应在高压消毒前置室温４８ｈ。７．３．２．３　被检样本制备将经高压消毒的皮样去除脂肪，剪取皮样１ｃｍ２或原毛数克放到浸样瓶中，并记录样品编号和相对应的浸样瓶编号。按照质量∶体积＝１∶５～１∶１０的比例加入０．５％石炭酸生理盐水至浸样瓶，放４℃冰箱浸泡１６ｈ～２４ｈ后，用中性滤纸滤过浸液，其澄清液为被检样本抗原，待检。７．３．２．４　正式试验７．３．２．４．１　炭疽沉淀素阳性血清对照试验先将炭疽沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加入斜置的Ａｓｃｏｌｉ反应管中，达到管高的三分之一处，然后吸取等量的标准炭疽抗原，沿反应管的管壁慢慢注入到沉淀素阳性血清上面（注意：不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，１５ｍｉｎ内判定结果。７．３．２．４．２　炭疽阴性血清对照试验先将炭疽沉淀素阴性血清沿管壁徐徐加入斜置的Ａｓｃｏｌｉ反应管中，达到管高的三分之一处，然后吸取等量的标准炭疽抗原，沿反应管的管壁慢慢注入到沉淀素阳性血清上面（注意：不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，１５ｍｉｎ内判定结果。７．３．２．４．３　空白对照试验先将炭疽沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加入斜置的Ａｓｃｏｌｉ反应管中，达到管高的三分之一处，然后吸取等量的０．５％石炭酸生理盐水，沿反应管的管壁慢慢注入到沉淀素阳性血清上面（注意：不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，１５ｍｉｎ内判定结果。４犛犖／犜２７０１—２０１０７．３．２．４．４　被检样品试验准备两支Ａｓｃｏｌｉ反应管，将炭疽沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加入其中一支斜置的Ａｓｃｏｌｉ反应管中，达到管高的三分之一处；同时按照同样方法，将炭疽沉淀素阴性血清加入另一支Ａｓｃｏｌｉ反应管中。将等量的被检皮毛样抗原分别徐徐加入到炭疽沉淀素阳性血清反应管和阴性血清对照反应管中（注意：不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，１５ｍｉｎ内判定结果。７．３．２．５　结果判定结果判定如下：ａ）　炭疽沉淀素阳性血清对照试验，两液接触面出现清晰、致密如线的白色沉淀环；ｂ）　炭疽阴性血清对照试验和空白对照试验，两界面无白色沉淀环出现；ｃ）　被检样品试验。阴性血清对照反应管：应呈阴性反应，两界面无白色沉淀环出现。当对照试验成立时，方可判定反应结果。阴性反应：反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且没有出现白色沉淀环。阳性反应：反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且出现清晰、致密如线的白色沉淀环。可疑：当反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且出现模糊、疏松、不明显的白色沉淀环时，则可初步判定反应结果为可疑。出现可疑结果时，应对被检测样本进行第二次试验，第二次试验如出现阴性或阳性反应时，则可判定反应结果为阴性或阳性，如结果再次可疑，则可确定反应结果为阳性。７．４　聚合酶链反应（犘犆犚）７．４．１　引物序列以下引物用于证实毒素质粒ｐＸ０１和荚膜质粒ｐＸ０２的存在，引物序列见表１。表１　犘犆犚引物序列靶基因引物序列号引物序列ＰＣＲ产物大小保护性抗原（ＰＡ）ＰＡ５３０４８３０２９５’ＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＧＡＡＧＴＣＧ３’ＰＡ８２４５２２４７１５’ＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＡＣＧＧＴ３’５９６ｂｐ荚膜１２３４