SNT 2452-2010 绵羊痘和山羊痘检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４５２—２０１０绵羊痘和山羊痘检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狋犺犲狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉狊犺犲犲狆狆狅狓犪狀犱犵狅犪狋狆狅狓２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言本标准参照ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（２００８年）中第２．７．１４章制定。本标准的附录Ａ、附录Ｂ、附录Ｃ和附录Ｄ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王海艳、刘中学、赵林立、刘虹、敖威华、高志强、季新成、薛强、乔彩霞、任立新。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４５２—２０１０绵羊痘和山羊痘检疫技术规范１　范围本标准规定了绵羊痘和山羊痘流行病学调查、临床症状与病理学观察、实验室检测等技术内容。本标准适用于绵羊痘和山羊痘的诊断、检疫。２　设备和材料２．１　恒温培养箱、恒温水浴箱、冰箱。２．２　生物显微镜、透射电子显微镜。２．３　高压灭菌器、高速冷冻离心机。２．４　单道微量加样器：１μＬ～１０μＬ，１００μＬ，２００μＬ，１０００μＬ。２．５　细胞培养瓶：２５ｃｍ２。２．６　酶标仪、蛋白凝胶电泳仪、电转印仪。３　培养基和试剂３．１　Ｈａｎｋ’ｓ液：见附录Ａ第Ａ．１章。３．２　０．２５％胰酶消化液：见附录Ａ第Ａ．２章。３．３　ＭＥＭ细胞培养液：具体配制方法按厂家规定的程序进行，用０．２μｍ的滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，４℃保存备用。３．４　ＥＤＴＡ胰蛋白酶分散液：见附录Ａ第Ａ．３章。３．５　抗生素溶液：见附录Ａ第Ａ．４章。３．６　绵羊痘和山羊痘抗原及相应的标准阴性血清和标准阳性血清。３．７　青霉素、链霉素、制霉菌素（或两性霉素）、新霉素。３．８　ＰＢＳ溶液：见附录Ａ第Ａ．５章。３．９　１０×Ｔｒｉｓ甘氨酸电泳缓冲溶液（ｐＨ８．３）：见附录Ａ第Ａ．６章。３．１０　转移缓冲溶液：见附录Ａ第Ａ．７章。３．１１　硝酸纤维素膜、胎牛血清、蛋白质分子量Ｍａｒｋｅｒ、牛血清白蛋白、辣根过氧化物酶标记的兔（或小鼠）抗羊ＩｇＧ。３．１２　１２％分离胶：见附录第Ａ．８章。３．１３　５％的积层胶：见附录Ａ第Ａ．９章。３．１４　１×ＳＤＳ凝胶上样缓冲液：见附录Ａ第Ａ．１０章。３．１５　考马斯亮蓝染色液：见附录Ａ第Ａ．１１章。３．１６　１％磷钨酸溶液（ｐＨ７．２）：见附录Ａ第Ａ．１２章。３．１７　琼脂板：见附录Ａ第Ａ．１３章。３．１８　底物溶液：见附录Ａ第Ａ．１４章。３．１９　苏木素染色液：见附录Ａ第Ａ．１５章。３．２０　０．５％伊红染色液：见附录Ａ第Ａ．１６章。３．２１　无水乙醇、二甲苯。３．２２　石蜡：熔点分别为５２℃～５４℃，５４℃～５６℃，５６℃～５８℃。３．２３　绵羊羔睾丸细胞的制备：见附录Ｂ。１犛犖／犜２４５２—２０１０４　临床症状见附录Ｃ。５　检测方法５．１　病毒电镜观察５．１．１　将活体或死后的皮肤丘疹、肺部的病灶或淋巴结用灭菌剪刀和镊子切碎后，放入灭菌的研钵内加入灭菌砂后进行研磨。研碎后加入等体积含抗生素（青霉素［１０００单位／ｍＬ］，链霉素［１ｍｇ／ｍＬ］，制霉菌素［１００单位／ｍＬ］或两性霉素［２．５μｇ／ｍＬ］，新霉素［２００单位／ｍＬ］）的ＰＢＳ溶液制成样品悬液。将样品悬液反复冻融三次后，于６００犵离心１０ｍｉｎ，取上清液保存备用。５．１．２　取一滴上清液置于载玻片上，将４００目碳网膜漂浮于液滴上１ｍｉｎ，再置于一滴ＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液中浸泡２０ｓ，然后用一滴１％的磷钨酸溶液（ｐＨ７．２）染色１０ｓ。取出碳网膜，用滤纸吸干膜上液体，待自然干燥后镜检。５．１．３　结果判定：羊痘病毒颗粒应呈砖形，其表面有短管状物覆盖，大小约２９０ｎｍ×２７０ｎｍ。有些病毒粒子周围有寄主细胞膜包裹。５．２　包涵体检查５．２．１　病料采集采集病变组织用于组织学检测，病变组织周围应该连带一些健康组织，采集后的组织立即放入１０％的福尔马林溶液中固定２４ｈ。５．２．２　切片制备将用福尔马林溶液固定的组织材料按照常规石蜡切片的制备方法制备切片。制备方法见附录Ｄ中第Ｄ．１章。５．２．３　染色用ＨＥ染色法进行染色，ＨＥ染色方法见附录Ｄ中第Ｄ．２章。５．２．４　结果判定染色后的切片置光学显微镜下观察。羊痘感染病料的组织细胞，细胞质内应有不定形的噬酸性包涵体，细胞核内有空泡。５．３　琼脂扩散试验５．３．１　操作方法５．３．１．１　被检抗原悬液的制备将按照５．１．１的方法制备的样品悬液接种绵羊睾丸单层细胞。接种时，取覆盖面达９０％的绵羊睾丸细胞单层，弃去培养液，每瓶接种１ｍＬ接种物，接种后于３７℃温箱吸附１ｈ（期间轻轻摇动两次），用ＰＢＳ溶液洗去残余接种物，然后加入ＭＥＭ细胞培养液（内含３％～５％胎牛血清和１％抗生素溶液）１０ｍＬ，置３７℃温箱中培养。当细胞病变达９０％时，收获细胞，反复冻融两次后，于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，将大部分上清液移入另外的洁净容器内。用剩余的上清液将沉淀重悬，用超声波裂解１ｍｉｎ后，于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，将上清液与第一次离心收集的上清液混合。将收集的上清液加入等体积的饱和硫酸铵溶液（ｐＨ７．４）于４℃作用１ｈ。将该溶液于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集沉淀并用０．８％的生理盐水０．１ｍＬ～０．５ｍＬ重悬后作为被检抗原悬液。　５．３．１．２　打孔在制备的琼脂板上打７个孔，中央１个，周围６个，孔径约５ｍｍ，周围各孔间及各孔与中央孔间距７ｍｍ。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，勿伤边缘，以免渗漏。５．３．１．３　封底用酒精灯烤琼脂板底部，封闭孔的底部，以防侧漏。２犛犖／犜２４５２—２０１０５．３．１．４　加样用微量移液器吸取１８μＬ羊痘标准阳性血清加入中央孔，在周围三个孔中隔孔加入１８μＬ标准抗原悬液，将按照５．３．１．１的方法制备的１８μＬ被检抗原悬液加入其余三个外周孔中。每加一种样品更换一次吸头。５．３．１．５　作用加样完毕后，静置５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，待孔中液体全部渗入琼脂后将平皿倒置放入湿盒内，于室温下放置，分别于２４ｈ、４８ｈ及７２ｈ后观察并记录结果。５．３．２　结果判定将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立，否则视为无效，需重做。若被检抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间出现沉淀线，并与标准抗原悬液孔的沉淀线末端相吻合，则被检样品判为阳性。若被检抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间未出现沉淀线，但标准抗原悬液孔的沉淀线一端弯向被检抗原悬液孔，则被检样品判为弱阳性，凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性。若被检抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间未出现沉淀线且标准抗原悬液沉淀线直向被检抗原悬液孔或向其外侧偏弯，则被检样品判为阴性。若被检抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间的沉淀线与标准抗原悬液孔和中心标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉直伸，则判为非特异性反应，应重复该试验。若仍出现非特异性反应则判为阴性。５．４　中和试验５．４．１　稀释５．４．１．１　抗原稀释将按照５．１．１的方法制备的上清液作为待检可疑病料，用Ｈａｎｋ’ｓ液分别将待检可疑病料和羊痘病毒标准对照作１∶１００倍稀释。５．４．１．２　标准阳性血清稀释用Ｈａｎｋ’ｓ液将标准阳性血清做１∶２倍稀释。５．４．２　加样５．４．２．１　取两支试管分别加入待检可疑病料稀释液０．５ｍＬ。向其中一支试管中加入等量标准阳性血清稀释液，向另一支试管中加入等量Ｈａｎｋ’ｓ液。５．４．２．２　另取两支试管，向其中一支试管中加入羊痘抗原稀释液０．５ｍＬ，向另一支试管中加入标准阳性血清稀释液０．５ｍＬ，然后分别加入等量Ｈａｎｋ’ｓ液作为羊痘病毒标准对照和阳性血清对照。５．４．３　中和将各试管混合物摇匀后置３７℃水浴中和１ｈ，期间每隔１５ｍｉｎ振摇一次。５．４．４　接种将每管混合物分别接种两瓶绵羊睾丸单层细胞。接种时，取覆盖面达９０％的绵羊睾丸细胞单层，弃去培养液，每瓶接种１ｍＬ接种物，接种后于３７℃温箱吸附１ｈ（期间轻轻摇动两次），用ＰＢＳ溶液洗去残余接种物，然后加入ＭＥＭ细胞培养液（内含３％～５％胎牛血清和１％抗生素溶液）１０ｍＬ，置３７℃温箱中培养。同时设两瓶正常细胞对照。５．４．５　观察每天观察细胞病变情况，观察４ｄ～６ｄ。病变细胞的特征是细胞出现间隙，形成圆细胞并聚积成簇，胞浆内颗粒增多，显示出退行性变化，失去正常形态，最终呈网状并脱落。５．４．６　结果判定当正常对照细胞和阳性血清对照细胞均不出现细胞病变，而接种羊痘抗原的细胞出现细胞病变，试验成立，否则试验失败，应该重做。３犛犖／犜２４５２—２０１０当中和后的待检可疑病料接种的细胞不出现细胞病变，而未经中和的待检可疑病料接种的细胞出现与羊痘抗原接种的细胞相同的病变，则判待检样品中含有羊痘病毒。当中和后的待检可疑病料和未经中和的待检可疑病料接种的细胞均不出现细胞病变，则判待检样品中不含羊痘病毒。５．５　犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋分析５．５．１　病毒表达蛋白的样品制备取覆盖面达９０％的绵羊睾丸细胞单层，弃去培养液，每瓶接种１ｍＬ羊痘病毒，接种后于３７℃温箱吸附１ｈ（期间轻轻摇动两次），用ＰＢＳ溶液洗去残余接种物，然后加入ＭＥＭ细胞培养液（内含３％～５％胎牛血清和１％抗生素溶液）１０ｍＬ，置３７℃温箱中培养。当细胞病变达９０％时，收获细胞，反复冻融三次后，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去上清液。在每份样品沉淀中加入１００μＬ１×ＳＤＳ凝胶上样缓冲液，涡旋振荡混匀，于沸水浴中作用５ｍｉｎ，然后冰浴２ｍｉｎ备用。５．５．２　分离胶的制备用微量移液器将制备好的分离胶加入已固定密封好的制胶板中，待其凝固后，灌注积层胶。５．５．３　积层胶的制备用微量移液器将制备好的积层胶加入已经凝固的分离胶的上面，加满后插入加样梳。５．５．４　加样待胶凝固后，取下梳子。将凝胶固定于电泳装置上，加入Ｔｒｉｓ甘氨酸电泳缓冲液。将样品加入样品孔。５．５．５　电泳当样品在积层胶时，电泳电压为５０Ｖ，待其到达分离胶后，将电压调至８０Ｖ，继续电泳直至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳。５．５．６　转膜将电泳后的聚丙烯酰胺凝胶用去离子水冲洗后，将其平放于用转移缓冲液预湿的硝酸纤维素膜上，使两者完全吻合并除尽气泡，在膜下和胶上分别放置３张用转移缓冲液预湿的滤纸，置于电转印仪中，转印１ｈ～１．５ｈ。５．５．７　印迹反应５．５．７．１　切取含有蛋白质分子量标记的硝酸纤维素膜，用考马斯亮蓝染色液染色数秒，再用脱色液进行脱色。５．５．７．２　将余下的硝酸纤维素膜用ＰＢＳ溶液充分漂洗两次后，放置于３％～５％的牛血清白蛋白于３７℃封闭１ｈ（或４℃封闭过夜）。　５．５．７．３　用ＰＢＳ溶液洗膜两次，按照加样孔的位置将硝酸纤维素膜分成若干条，每个加样孔对应一条，将其分别放置于经５０倍稀释的不同的被检血清中，同时取另外两条分别放置于５０倍稀释的标准阳性血清和标准阴性血清中作对照，室温下作用１．５ｈ。５．５．７．４　用ＰＢＳ溶液洗膜五次，按照说明书的稀释比例加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊ＩｇＧ稀释液，室温下平缓摇动１．５ｈ。５．５．７．５　用ＰＢＳ溶液洗膜三次后，将其放置于１０ｍＬ底物溶液中，避光观察３ｍｉｎ～７ｍｉｎ，待其出现显色反应后，立即取出放置于蒸馏水中终止反应。５．５．７．６　结果判定当用阳性对照血清作用的硝酸纤维膜分别出现６７、３２、２６、１９和１７ｋＤ分子量的蛋白条带，而阴性对照血清作用的硝酸纤维膜不出现这些蛋白条带时，证明试验成立，否则实验失败，应该重做。当待检血清作用的硝酸纤维膜出现与阳性对照血清作用的硝酸纤维膜一样大小的蛋白条带时，证明待检血清阳性。当待检血清作用的硝酸纤维膜不出现与阳性对照血清作用的硝酸纤维膜一样大小的蛋白条带时，证明待检血清阴性。４犛犖／犜２４５２—２０１