SNT 2330-2009 化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２３３０—２００９化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验犆狅狊犿犲狋犻犮狊犲犿犫狉狔狅狋狅狓犻犮犻狋狔犪狀犱犱犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犪犾狋狅狓犻犮犻狋狔狅犳犿犻犮犲犲犿犫狉狔狅狀犻犮狊狋犲犿犮犲犾犾狋犲狊狋２００９０７０７发布２０１００１１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验ＳＮ／Ｔ２３３０—２００９中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张１．２５　字数３２千字２００９年１１月第一版　２００９年１１月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１９９４２　定价２１．００元书书书前　　言　　本标准的附录Ａ、附录Ｂ、附录Ｃ、附录Ｄ为资料性附录，附录Ｅ为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中山大学。本标准主要起草人：程树军、项鹏、焦红、陈蕊、秦瑶、温巧玲、许崇辉、潘芳。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２３３０—２００９化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验１　范围本标准规定了化妆品胚胎和发育毒性小鼠胚胎干细胞试验的试验原理、试验准备、试验方法、结果和报告。本标准适用于化妆品原料／化学品潜在胚胎毒性的筛选和检测。本标准为胚胎和发育毒性的动物试验的替代方法之一，结合其他替代试验或动物试验用于化学物质毒性的整体评价。本标准也可供制药、农业、工业化学物质、食品添加剂和其他污染物胚胎和发育毒性试验的参考。２　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。２．１胚胎干细胞　犲犿犫狉狔狅狀犻犮狊狋犲犿犮犲犾犾狊，犈犛来源于胚胎内细胞团或原始生殖细胞，能无限分裂并保持未分化状态，具有向胚胎三个胚层来源的所有细胞分化的能力。２．２胚胎体　犲犿犫狉狔狅犻犱犫狅犱犻犲狊，犈犫狊在体外培养环境中，胚胎干细胞培养体系中撤除抑制细胞分化的因子，胚胎干细胞就会失去保持未分化状态的能力，可以自发形成多细胞结构，即胚胎体，胚胎体中含有内胚层、中胚层和外胚层３个胚层的细胞。２．３分化　犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀分化是一个过程。在分化的过程中，细胞内一些特定的基因开始表达，而其他基因并不表达，从而一个非特化的细胞特化成为一个具有特殊结构并执行一定功能的细胞。２．４成纤维细胞　犳犻犫狉狅犫犾犪狊狋是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起，细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。２．５胚胎毒性　犲犿犫狉狔狅狋狅狓犻犮犻狋狔外源性化学物直接或间接地作用于胚胎产生胚胎毒作用，表现为妊娠着床前早期或着床后阶段胚胎的自动丢失，如吸收、流产、死胎和整个胚胎或器官和系统生长发育迟缓等。２．６小鼠白血病抑制因子　犿犻犮犲犾犲狌犮犽犲犿犻犪犻狀犺犻犫犻狋狅狉狔犳犪犮狋狅狉，犿犔犐犉用于维持小鼠胚胎干细胞增殖和未分化的状态的一类生长因子。２．７悬滴培养　犺犪狀犵犻狀犵犱狉狅狆犿犲狋犺狅犱用于诱导胚胎干细胞分化为胚胎体样结构的一种细胞培养方法，以观察细胞生长和发育过程。１犛犖／犜２３３０—２００９２．８半数抑制浓度　犐犇５０抑制ＥＳ细胞分化为心肌细胞５０％的受试物浓度。２．９胚胎干细胞半数致死浓度　犐犆５０犈犛ＥＳ细胞生长和活力抑制５０％的受试物浓度。２．１０成纤维细胞半数致死浓度　犐犆５０３犜３３Ｔ３成纤维细胞生长和活力抑制５０％的受试物浓度。３　试验原理胚胎毒性试验或用妊娠动物在体内进行，或用培养的胚胎以及来自妊娠动物的胚胎组织或细胞在体外进行。这几种体内和体外试验必须以牺牲动物为代价。本试验基于胚胎毒性作用中最重要的指标，即受试物对胚胎和成体组织的毒性损伤存在敏感性差异，这种差异与分化的抑制程度密切相关，胚胎干细胞（ＥＳ）对毒性物质的反应比成体细胞更为敏感。本试验采用两个永生化的小鼠细胞系：ｍＥＳ为小鼠胚胎干细胞，代表胚胎组织；３Ｔ３为成纤维细胞，代表成体组织。ｍＥＳ细胞在白血病抑制因子（ｍＬＩＦ）存在的情况下能保持未分化状态，在适当条件下ＥＳ细胞具有形成胚胎体和分化成主要的胚胎组织的能力。通过评价抑制胚胎干细胞分化的能力和抑制ＥＳ、３Ｔ３细胞生长的能力，预测受试物的潜在胚胎毒性。４　试验材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，试剂最好选用进口试剂。４．１　细胞４．１．１　胎鼠成纤维细胞（Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３细胞）：来源于Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，最好来源于美国标准生物品收藏中心（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）。４．１．２　小鼠ＥＳ细胞（ｍＥＳ）：推荐ＥＳＤ３细胞系，来源于１２９小鼠，最好来源于ＡＴＣＣ（Ｎｏ．ＣＲＬ１９３４）；如有充分证明，也可使用其他细胞系，如Ｅ１４Ｔｇ２Ａ（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１８２１）。欧洲细胞培养物保藏中心（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ，ＥＣＡＣＣ）。４．２　细胞培养基制备４．２．１　３Ｔ３常规培养基／检测培养基：１０％胎牛血清（ＦＣＳ）、４ｍｍｏｌ／ＬＬ谷氨酰胺、５０Ｕ／ｍＬ青霉素、５０μｇ／ｍＬ链霉素。４．２．２　３Ｔ３冻存培养基：２０％ＦＣＳ、４ｍｍｏｌ／ＬＬ谷氨酰胺、５０Ｕ／ｍＬ青霉素、５０μｇ／ｍＬ链霉素、１０％ＤＭＳＯ。４．２．３　ｍＥＳ完全培养基：２０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬＬ谷氨酰胺、５０Ｕ／ｍＬ青霉素、５０μｇ／ｍＬ链霉素、１％ＮＡＡ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌβ疏基乙醇、１０００Ｕ／ｍＬｍＬＩＦ，４℃保存不超２周，用于ＥＳ细胞维持未分化状态。４．２．４　ｍＥＳ检测培养基：２０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬＬ谷氨酰胺、５０Ｕ／ｍＬ青霉素、５０μｇ／ｍＬ链霉素、１％ＮＡＡ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌβ疏基乙醇。４．２．５　ｍＥＳ冻存培养基：４０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬＬ谷氨酰胺、５０Ｕ／ｍＬ青霉素、５０μｇ／ｍＬ链霉素、１％ＮＡＡ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ疏基乙醇、１０％ＤＭＳＯ。４．３　试验试剂４．３．１　ＨＤＭＥＭ：高糖ＤＭＥＭ，推荐Ｇｉｂｃｏ公司或ＨｙＣｌｏｎｅ公司的产品。４．３．２　Ｌ谷氨酰胺。４．３．３　胎牛血清（ＦＣＳ）：５６℃加热灭活３０ｍｉｎ。２犛犖／犜２３３０—２００９４．３．４　小牛血清：５６℃加热灭活３０ｍｉｎ。４．３．５　胰酶／ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ）：配成０．２５％。４．３．６　青霉素／链霉素双抗：青霉素（１００Ｕ／ｍＬ），链霉素（１００μｇ／ｍＬ）。４．３．７　二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）：用于非水溶性化学品溶剂，或用于冻存细胞。４．３．８　非必须氨基酸（Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ＮＡＡ）。４．３．９　β疏基乙醇（βｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，βＭＥ）：工作液浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ，可用ＰＢＳ配制，４℃下可保存１周。４．３．１０　小鼠白血病抑制因子（ｍＬＩＦ）：原液浓度为１０６Ｕ／ｍＬ的ｍＬＩＦ，－２０℃保存，融解后保存在４℃，可保持活性约１年；原液浓度为１０７Ｕ／ｍＬ的ｍＬＩＦ，可用ＰＢＳ（含１％ＢＳＡ）或培养基按１∶１０稀释后保存在－２０℃或４℃。４．３．１１　噻唑蓝，３（４，５ｄｉｍｅｔｈｙｌ２ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）２，５ｄｉｐｈｅｎｙｌ２Ｈｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＭＴＴ。４．３．１２　异丙醇（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ或ｐｒｏｐａｎ２ｏ１）。４．３．１３　十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），又称月桂基硫酸钠（ＳＬＳ）：用水配成２０％储存液，室温保存。４．３．１４　磷酸缓冲液（ＤＰＢＳ）：无Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋，保存于室温或４℃冰箱中。４．３．１５　５氟尿嘧啶（５ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，５ＦＵ）：阳性对照物，以ＤＰＢＳ配制，按终浓度２ｍｇ／ｍＬ分装保存于－２０℃。４．３．１６　青霉素Ｇ：阴性对照物，以终浓度１０００Ｕ／ｍＬ分装保存于－２０℃。４．３．１７　牛血清白蛋白（ＢＳＡ）：组织培养用。４．３．１８　台盼蓝：配制成１０ｍｇ／ｍＬ水溶液。４．３．１９　超纯水。４．３．２０　无水乙醇。４．４　犕犜犜溶液４．４．１　ＭＴＴ贮存液：通常使用的浓度为５ｍｇ／ｍＬ。称取ＭＴＴ０．５ｇ，溶于１００ｍＬ的磷酸缓冲液（ＰＢＳ），用０．２２μｍ滤膜过滤除菌，４℃避光保存。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包裹。需注意，ＭＴＴ法只能用来检测细胞相对数量和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，ＭＴＴ吸光度最好在０～０．７范围内。４．４．２　ＭＴＴ解吸液：３．４９ｍＬ２０％的ＳＤＳ贮存液与９６．５１ｍＬ异丙醇混合，使用前新鲜配制，如出现沉淀温育至３７℃。４．５　耗材４．５．１　培养瓶：２５ｃｍ２和７５ｃｍ２，用于常规培养。４．５．２　培养皿：６０×１５ｍｍ和１００×２０ｍｍ，用于细胞常规培养和悬滴培养。４．５．３　９６孔平底组织培养微孔板。４．５．４　２４孔组织培养板。４．５．５　２ｍＬ细胞冻存管。４．５．６　０．２２μｍ微孔滤膜。４．５．７　不透光管（ｌｉｇｈｔｔｉｇｈｔｔｕｂｅｓ）或铝薄纸遮蔽管（ｗｒａｐｔｕｂｅｓ）：用于光敏性物质溶液的配制。４．５．８　封口膜：用于封闭９６孔板，防止化学物质挥发，如Ｄｙｎａｔｅｃｈ公司（ＣａｔＮｏ．Ｍ３０）。４．６　仪器和设备４．６．１　培养箱：温度３７℃±１℃，相对湿度９０％±５％，５％±１％ＣＯ２。４．６．２　层流洁净柜（生物安全标准）。４．６．３　恒温水浴箱：温度３７℃±１℃。４．６．４　倒置相差显微镜。４．６．５　电子天平（精确到０．００１）。３犛犖／犜２３３０—２００９４．６．６　９６孔板分光光度计（酶标仪）。４．６．７　移液器：单通道或多通道移液器。４．６．８　微孔板摇床。４．６．９　细胞计数仪或血球计数器。４．６．１０　离心机（最好配有微孔板转子）。５　试验过程５．１　受试物溶液的制备５．１．１　溶剂参照附录Ａ把受试物溶解在合适的溶剂中。所选择的溶剂其浓度不能具有细胞毒性和对细胞分化有任何影响，且该浓度在试验过程中应始终保持一致。各溶剂推荐的最高浓度ＤＭＳＯ为０．２５％，乙醇为０．５％。５．１．２　预试验受试物浓度范围的设置以受试物的最高溶解浓度和无细胞毒性的最高溶剂浓度作为最高试验浓度，推荐采用２倍系列稀释法制备受试物浓度。５．１．３　正式试验受试物浓度范围的设置以１０进制几何浓度序列稀释法，在梯度为１．２～３之间，按５．１．２“预试验”中确定的剂量反应关系范围，以较小的稀释倍数制备６个～８个试验浓度。如稀释因子２．１５（＝３槡１０）将一个ｌｏｇ单位分成等距离的３个间隔。稀释因子１．７８（＝４槡１０）将一个ｌｏｇ单位分成等距离的４个间隔。稀释因子１．４７（＝６槡１０）将一个ｌｏｇ单位分成等距离的６个间隔。稀释因子１．２１（＝１２槡１０）将一个ｌｏｇ单位分成等距离的１２个间隔。以因子１．４７作为例子。加入０．４７体积的稀释液稀释１体积最高浓度的溶液，混合均匀，取一体积此溶液加入０．４７体积的稀释液，依次同样操作６次，即可得到以１．４７为稀释因子的十进制序列稀释液。正式试验应设１个浓度的阳性对照物质（见５．３．３）。５．１．４　注意事项受试物制备应注意以下几点：ａ）　任何化学物质的最大试验浓度是１０００μｇ／ｍＬ；ｂ）　不要使用ｍＥＳ完全培养基制备受试物贮存液，因为血清蛋白质、受试物或其他成分可能在反复冻融中出现沉淀；ｃ）　提前制备贮存液，包括阳性对照物５氟尿嘧啶、双抗、阴性对照物青霉素Ｇ等可以冻存于－２０℃；ｄ）　强酸和强碱化学物质可能影响培养基的缓冲能力，因此受试物溶解后，应目测检查最高浓度受试物培养基的ｐＨ值，如变紫或浅黄（ｐＨ＞８或ｐＨ＜６．５），表明培养基缓冲能力下降，贮存液应用０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠或０．１ｍｏ１／Ｌ盐酸中和