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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖/犜2127—2008进出口动物源性食品中β内酰胺类药物残留检测方法 微生物抑制法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳β犾犪犮狋犪犿狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犕犐犃犿犲狋犺狅犱20080904发布20090316实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:郑晶、黄晓蓉、吴谦、冯家望、翁国柱、张体银、郑麟毅、吴芸芸。本标准系首次发布的出入境检验检疫标准。Ⅰ犛犖/犜2127—2008进出口动物源性食品中β内酰胺类药物残留检测方法 微生物抑制法1 范围本标准规定了动物源性食品中β内酰胺类药物残留检测的试样制备、保存和微生物抑制检测方法。本标准适用于牛奶、肉类、鱼和虾中的苄青霉素、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、苯唑青霉素和头孢噻呋等药物残留筛选检测,阳性结果应用其他方法进行确证。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—2008,ISO3696:1987,MOD)3 试样制备和保存3.1 试样制备3.1.1 牛奶:取不少于500mL试样,装入清洁容器内,并标明标记。3.1.2 肉类、鱼和虾:从原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速捣碎机均质,充分混匀,用四分法缩分不少于500g试样。装入清洁容器内,并标明标记。3.1.3 制样操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。3.2 试样保存3.2.1 牛奶:0℃~4℃保存。3.2.2 肉类、鱼和虾:试样于-18℃以下保存,新鲜或冷冻组织样品可在2℃~6℃保存72h。4 测定方法4.1 方法提要试样经缓冲液提取、温育和离心后,取上清液进行测定。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生素。4.2 设备和材料4.2.1 恒温箱:63℃±1℃。4.2.2 离心机。4.2.3 高速组织捣碎机。4.2.4 恒温水浴锅:80℃。4.2.5 涡旋振荡器。4.2.6 显微镜:10×~100×。4.2.7 游标卡尺:测量范围0mm~200mm,精度0.02mm或抑制圈测量仪。4.2.8 灭菌平皿:直径90mm,底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平皿。4.2.9 圆形滤纸片:直径10mm,厚1.1mm。日本ToyoRoshiKaisha,Ltd.产品或同类产品。4.2.10 克氏瓶。1犛犖/犜2127—20084.2.11 可调移液器:10μL~100μL,100μL~1000μL。4.3 菌种和培养基4.3.1 菌种嗜热脂肪芽孢杆菌 犅犪犮犻犾犾狌狊狊狋犲犪狉狅狋犺犲狉犿狅狆犺犻犾狌狊ATCC10149。4.3.2 培养基4.3.2.1 细菌保存培养基:见附录A第A.1章。4.3.2.2 菌种芽孢培养基:见附录A第A.2章。4.3.2.3 检定培养基:见附录A第A.3章。4.4 试剂除非另有说明,本标准所用化学试剂均为分析纯,试验用水应符合GB/T6682的规定。4.4.1 1.0犿狅犾/犔盐酸溶液量取90mL浓盐酸用蒸馏水稀释至1000mL。4.4.2 1.0犿狅犾/犔氢氧化钠准确称取4.0g氢氧化钠,溶解于100mL蒸馏水中。4.4.3 缓冲液4.4.3.1 pH6.0磷酸盐缓冲液:称取8.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)及2.0g磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O),用蒸馏水溶解并定容至1000mL,121℃高压灭菌15min。4.4.3.2 磷酸盐缓冲液丙酮磷酸盐缓冲液丙酮:按体积比pH6.0磷酸盐缓冲液∶丙酮=1∶1比例制备。4.4.4 抗生素标准液4.4.4.1 标准品:苄青霉素,纯度≥99%。4.4.4.2 苄青霉素标准储备液:准确称取适量的苄青霉素标准品,用灭菌pH6.0磷酸盐缓冲液(4.4.3.1)溶解并定容至1000μg/mL,置2℃~8℃冰箱保存,贮存期7d。4.4.4.3 苄青霉素标准工作液:吸取适量的苄青霉素标准储备液,用pH6.0磷酸盐缓冲液(4.4.3.1)稀释成0.005μg/mL的标准工作液,应当日配制使用。4.5 测定步骤4.5.1 样液提取4.5.1.1 牛奶:取20mL鲜奶于50mL离心管,3000r/min离心5min,除去上层脂肪层,以1.0mol/L盐酸溶液或1.0mol/L氢氧化钠调节pH至6.5~7.0。脱脂奶可直接用于检测。4.5.1.2 肉类、鱼和虾:称取10.0g均质好的试样于50mL离心管中,加入磷酸盐丙酮缓冲液10mL,用涡旋振荡器充分振荡3min,于80℃水浴保温30min后,3000r/min离心15min取上清液作为样液。4.5.2 菌悬液的制备嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC10149菌悬液:一般情况下,菌种的传代次数不应超过5代,否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异,或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后,将复活的菌种分别接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中,55℃±1℃培养72h镜检芽孢数达80%以上(如果达不到,可再培养数日,芽孢数仍达不到要求,菌种可能变异,不可使用),用灭菌生理盐水洗下菌苔,使其悬浮于生理盐水中,80℃水浴加热30min,经3000r/min离心20min,弃去上清液,如此重复洗涤芽孢两次。然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液,用稀释平板计数的方法或比浊法进行计数以确定菌种的浓度。置2℃~8℃冰箱保存,贮存期30d。4.5.3 检定用平板的制备将试验菌悬液按一定的比例加入到融化后冷却至60℃左右的灭菌检定培养基中充分混匀后,使平板中的嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到1.0×106CFU/mL。在灭菌平皿中加入6mL混合液,保持水平2犛犖/犜2127—2008待其凝固。取制备好的检定用平板两个,分别放置两个滤纸片,加入约90μL(以纸片吸满为准)0.005μg/mL苄青霉素标准工作液,冷藏放置30min后,63℃±1℃培养3.5h能产生14mm以上清晰、完整抑菌圈的平板为合格,达不到要求的平板应弃去。制备好的平板置2℃~8℃冰箱可保存2d~3d。4.5.4 测定取制备好的检定用平板两个,在平板底部作好标记,将滤纸片适当间隔置于平板上,每个平板最多不超过6个,在其中一个滤纸片加入约90μL(以纸片吸满为准)0.005μg/mL苄青霉素标准工作液作为阳性对照,其余的滤纸片中加入约90μL样液,冷藏放置30min后,63℃±1℃培养3.5h后开始观察,如果0.005μg/mL苄青霉素标准工作液产生清晰、完整的抑菌圈且大于14mm时终止培养,记录标准工作液和样液的抑菌圈结果。每份样品做两个平板上的平行试验。4.6 检测结果判断和报告4.6.1 如果样液在平板上无抑菌圈,0.005μg/mL苄青霉素标准工作液的抑菌圈直径大于14mm,即报告“阴性”。4.6.2 如果样液在平板上呈现抑菌圈,抑菌圈直径在13mm以上,即报告“初筛阳性”。4.6.3 如果样液在平板上呈现抑菌圈,抑菌圈直径小于13mm,大于10mm,或者两个平行结果不一致时,视为可疑,应重新测试后判定。4.6.4 阳性样品需要用确证方法进行定性及定量分析。5 检测限本标准的检测限见表1。表1 β内酰胺类药物检测限β内酰胺类药物名称牛奶的检测限/(μg/kg)肉类、鱼和虾的检测限/(μg/kg)苄青霉素420氨苄青霉素420羟氨苄青霉素420邻氯青霉素20200双氯青霉素20200苯唑青霉素20200头孢噻呋1008003犛犖/犜2127—2008附 录 犃(规范性附录)培养基犃.1 细菌保存培养基犃.1.1 成分胰蛋白胨 15.0g植物蛋白胨5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.3±0.2犃.1.2 制法将各成分加热溶解,分装试管,121℃高压灭菌15min,制成斜面。注:制成半固体时,琼脂量为0.5%。犃.2 菌种芽孢培养基犃.2.1 成分胰蛋白胨 17.0g植物蛋白胨3.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g蒸馏水1000mL琼脂20gpH7.3±0.2犃.2.2 制法将各成分加热溶解,分装300mL于克氏瓶内,121℃高压灭菌15min。犃.3 检定培养基犃.3.1 成分牛肉膏 3.0g蛋白胨5.0g大豆蛋白胨0.3g葡萄糖5.25g氯化钠0.5g磷酸氢二钾0.25g吐温801.0g溴甲酚紫0.06g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.8±0.24犛犖/犜2127—2008犃.3.2 制法0.6%溴甲酚紫溶液配制:称取0.6g溴甲酚紫溶于100mL蒸馏水中。将各成分加热溶解,分装每瓶100mL,每瓶中加入0.6%溴甲酚紫溶液1mL,121℃高压灭菌15min。5犛犖/犜2127—2008犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊狀狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓犲.犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犼狌狉犻狊犱犻犮狋犻狅狀狅犳犆犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犃犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀犃犱犿犻狀犻狊狋狉犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪.犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔犉狌犼犻犪狀犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌犪狀犱犣犺狌犺犪犻犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪.犕犪犻狀犱狉犪犳狋犲狉狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犣犺犲狀犵犑犻狀犵,犎狌犪狀犵犡犻犪狅狉狅狀犵,犠狌犙犻犪狀,犉犲狀犵犑犻犪狑犪狀犵,犠犲狀犵犌狌狅狕犺狌,犣犺犪狀犵犜犻狔犻狀,犣犺犲狀犵犔犻狀狔犻犪狀犱犠狌狔狌狀狔狌狀.犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狉狅犳犲狊狊犻狅狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱犳狅狉犈狀狋狉狔犈狓犻狋犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅犿狌犾犵犪狋犲犱犳狅狉狋犺犲犳犻狉狊狋狋犻犿犲.6犛犖/犜2127—2008犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳β犾犪犮狋犪犿狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犕犐犃犿犲狋犺狅犱1 犛犮狅狆犲犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狊狆犲犮犻犳犻犲狊狋犺犲狊犪犿狆犾犲狆狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀,狆狉犲狊犲狉狏犪狋犻狅狀犪狀犱犿犻犮狉狅犫犻犪犾犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀犪狊狊犪狔犿犲狋犺狅犱犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳β犾犪犮狋犪犿狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀.犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狆犾犻犮犪犫犾犲狋狅狋犺犲狊犮狉犲犲狀犻狀犵犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀狅犳犅犲狀狕狔犾狆犲狀犻犮犻犾犾犻狀,犃犿狆犻犮犻犾犾犻狀,犃犿狅狓犻犮犻犾犾犻狀,犆犾狅狓犪犮犻犾犾犻狀,犇犻犮犾狅狓犪犮犻犾犾犻狀,犗狓犪犮犻犾犾犻狀犪狀犱犆犲犳狋犻狅犳狌狉狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犻犾犽,犿犲犪狋,犳犻狊犺犪狀犱狊犺狉犻犿狆.犃狀狔狆狅狊犻狋犻狏犲狉犲狊狌犾狋狊犺狅狌犾犱犫犲犮狅狀犳犻狉犿犲犱犫狔狅狋犺犲狉犿犲狋犺狅犱.2 犖狅狉犿犪狋犻狏犲犚犲犳犲狉犲狀犮犲犜犺犲犳狅犾犾狅狑犻狀犵狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犮狅狀狋犪犻狀狆狉狅狏犻狊犻狅狀狊狑犺犻犮犺,狋犺狉狅狌犵犺狉犲犳犲狉犲狀犮犲犻狀狋犺犻狊狋犲狓狋,犮狅狀狊狋犻狋狌狋犲狆狉狅狏犻狊犻狅狀狊狅犳狋犺犻狊狊
本文标题:SNT 2127-2008 进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法 微生物抑制法
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