SNT 2033-2007 绵羊地方性流产病微量补体结合试验操作规程

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!##!$绵羊地方性流产病微量补体结合试验操作规程$%&’&(&)&*+,(%&-(&+.)/+/0’*,12’,&0’/3’*&%/04&&’,(25&%’,&0&*/6/3!$-%!-!&发布!’-$-%实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行!业!标!准绵羊地方性流产病微量补体结合试验操作规程!!#$%&&$%%’中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街()号邮政编码#(%%%*+网址,,,-./0-123-01电话#)4+$&5*)!)4+(’+*4中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本44%6($&%(!()!印张%-’+!字数(+千字$%%4年&月第一版!$%%4年&月第一次印刷印数($%%%书号#(++%))$$7(4+%’!定价!-元书书书前!!言!!本标准的附录!!附录为规范性附录附录#!附录$为资料性附录#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位$中华人民共和国天津出入境检验检疫局#本标准主要起草人$王玉玲!侯艳梅!姜红!赵祥平!董志珍!霍蕾#本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准#!!!#!##!$绵羊地方性流产病微量补体结合试验操作规程%!范围本标准规定了绵羊地方性流产病微量补体结合试验的操作技术要求#本标准适用于绵羊地方性流产病的血清学诊断#!!规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款#凡是注日期的引用文件其随后所有的修改单%不包括勘误的内容&或修订版均不适用于本标准然而鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本#凡是不注日期的引用文件其最新版本适用于本标准#%$’&’’()!分析实验室用水规格和试验方法%*+,-./0’1’&#!试剂和材料#2%!试剂#2%2%!试验用蒸馏水为%$’&’’()中的三级水##2%2!!稀释液$生理盐水##2%2#!补体结合抗原$按说明书使用使用前充分摇匀##2%2&!阳性对照血清$使用前用蒸馏水溶解至规定容积##2%2’!阴性对照血清$使用前用蒸馏水溶解至规定容积##2%2(!溶血素$使用前用蒸馏水溶解至规定容积##2%2$!补体$使用前用蒸馏水溶解至规定容积##2%2)!绵羊全血$选健康成年绵羊无菌颈脉采血32)份阿氏液加3份血混匀45冰箱内稳定0676后使用##2!!材料#2!2%!玻璃试管$3899:;799圆底洁净##2!2!!试管架##2!2#!微量移液器##2!2&!可调连续加样器##2!2’!1’孔()型微量板##2!2(!1’孔平底%&微量板##2!2$!水平转子离心机##2!2)!=-.#读板仪##2#!被检血清#2#2%!采血和分离按常规方法采血和分离血清#血清应新鲜无蛋白絮凝物无溶血无腐败气味##2#2!!运送和保存血清防止血清冻结若06内不能送到实验室需用冷藏方法运送血清#血清应放至45冰箱内保存#3!!#!##!$&!操作方法&2%!预备试验&2%2%!#$红细胞悬浮液的制备&2%2%2%!绵羊全血充分混匀后取所需量用稀释液洗三次每次水平转子离心机)888?’9@*离心79@*最后一次离心389@*#&2%2%2!!取出3份沉积血泥加入到)4份稀释液中充分混匀制成红细胞悬浮液#&2%2%2#!取出)78#红细胞悬浮液加入到42;79蒸馏水中使红细胞充分破解%液体清亮&#&2%2%2&!取出388#破解后的液体加入到平底微量板孔内平行加(个孔#&2%2%2’!用=-.#读板仪748*9下读!值算出平均!值代入校正红细胞浓度公式*见式%3&+$#A$:%8&337B%%3&!!!!!!!!!!!!!!!!式中$#,,,校正红细胞浓度到0C所需加入的稀释液量-$,,,平均!值-%,,,红细胞悬浮液量#&2%2%2(!取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加入到红细胞悬浮液中即得0C红细胞悬浮液#&2%2!!溶血素效价的测定&2%2!2%!稀释溶血素取82)9溶血素原液加入到312(9稀释液中制成3D388稀释的溶血素再按表3稀释成不同稀释滴度的溶血素#表%!溶血素的稀释稀释滴度溶血素量’9稀释液’93D788%3D388溶血素&3284283D3888%3D388溶血素&)283(283D3788%3D388溶血素&827;283D)888%3D388溶血素&8271273D0888%3D3888溶血素&328)283D7888%3D3888溶血素&3284283D38888%3D3888溶血素&328128!!注$如果溶血素是由等量甘油保存则溶血素原液所需量加倍并相应减少稀释液量#&2%2!2!!制备不同稀释滴度的溶血素致敏红细胞取;个试管每管加32790C的红细胞悬浮液然后分别缓慢加入不同稀释滴度的溶血素3279混匀0;5水浴箱中感作379@*#&2%2!2#!溶血素效价的确定将补体原液预稀释至3D378按表)进行测定#表!!溶血素效价测定试管号3)047’;稀释液’93283283283283283283283’378补体’9827827827827827827827)!!#!##!$表!%续&试管号3)047’;不同稀释滴度致敏红细胞’9827827827827827827827溶血素稀释滴度3’7883’38883’37883’)8883’08883’78883’38888感作0;5水浴089@*%每间隔79@*振3次&冷稀释液’9)28)28)28)28)28)28)28!!将各管用水平转子离心机788:’离心09@*取上清液388#分注平底微量板748*9下读!值#按公式%!值:388’82337&算出各管溶血度在普通坐标纸上以溶血素的稀释度为横坐标溶血度为纵坐标绘制曲线确定出现平高线的点比此浓度高)7C的稀释度定为溶血素的工作效价%即为32)7倍溶血素工作效价A溶血素稀释滴度:(8C&%参见附录#&#&2%2#!制备致敏红细胞悬浮液按测定的溶血素效价稀释溶血素缓慢加入到等量的0C绵羊红细胞悬浮液中混合均匀置0;5水浴箱中感作379@*#&2%2&!补体效价的测定补体预稀释至3’378做)组重复管按表0进行测定#表#!补体效价测定试!管!号3)047’3’378补体’982082482782’82;82(稀释液’932)32332882182(82;第一次感作0;5水浴089@*致敏红细胞827827827827827827第二次感作0;5水浴089@*%每间隔79@*振3次&冷稀释液%9&)28)28)28)28)28)28!!将各管用水平转子离心机788:’离心09@*取上清液748*9下读!值按公式%双管平均!值:388’82337&计算出各管的溶血度%(&在双对数坐标纸上以(’%388B(&为横坐标补体用量为纵坐标制成一直线找出78C溶血时补体的用量%含3个!.E78单位&代入公式$补体稀释倍数’7:78C溶血时补体用量即得出本试验补体工作效价%含)27个!.E78单位&%参见附录$&#&2%2’!抗原效价的测定&2%2’2%!对照血清稀释灭活阳性对照血清和阴性对照血清分别用稀释液作3D4稀释置7(5水浴箱中灭活089@*#&2%2’2!!阳性对照血清倍比稀释见附录!#&2%2’2#!抗原从%*&作倍比稀释见附录!#&2%2’2&!建立方阵试验在()型微量反应板中进行#试验程序$)7#血清F)7#抗原F)7#补体0;5振荡感作489@*F)7#致敏红细胞#0;5振荡感作089@*同时设立血清对照!抗原对照!补体对照%见附录!&#&2%2’2’!记录测定结果取出微量反应板水平转子离心机788:’离心09@*与标准比色孔%比色孔的配制见附录&比0!!#!##!$较观察溶血度记录结果#&2%2’2(!抗原效价的确定在对照成立时与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价即为3个单位抗原本试验抗原使用)个单位#&2!!正式试验&2!2%!溶血素!抗原!补体按预试验测定的工作效价稀释#&2!2!!被检血清和阳性对照血清!阴性对照血清做3D4稀释置7(5水浴箱内灭活089@*#&2!2#!将灭活后的阳性对照血清和阴性对照血清在()微量反应板中进行倍比稀释#一般阳性对照血清做八个稀释度阴性对照血清可做三个稀释度#&2!2&!)7#血清F)7#抗原F)7#补体0;5振荡感作489@*F)7#致敏红细胞0;5振荡感作089@*同时建立阳性血清对照!阴性血清对照!抗原对照!补体对照和红细胞对照%见表4&#&2!2’!取出微量反应板水平转子离心机788:’离心09@*比照标准比色孔记录结果#表&!血清效价的测定项目稀!释!度血清试验孔血清抗补体对照3’43’(3’3’3’0)3’’43’3)(3’)7’3’73)3’4抗原对照补体对照)27个补体单位32)7个补体单位82’)7个补体单位红细胞对照血清’#)7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,,,抗原’#)7)7)7)7)7)7)7)7,)7,,,,稀释液’#,,,,,,,,)7)7787878;7补体’#)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7,第一次感作0;5振荡489@*致敏红细胞’#)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7第二次感作0;5振荡089@*’!判定’2%!被检血清效价的确定比照标准比色孔判读达到78C抑制溶血时血清的最高稀释度为该血清的效价#’2!!结果判定’2!2%!各对照的结果成立时可进行判定#否则补体的效价应重新测定并重新做42)试验#阳性血清对照$阳性对照血清效价与已知效价或预测效价变化范围不超过一个滴度#阴性血清对照$388C溶血#血清抗补体对照$抗补体对照孔388C溶血%如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相同说明该血清为抗补体&#抗原对照$388C溶血#补体对照$,,,)27个单位补体对照$388C溶血-,,,32)7个单位补体对照$部分溶血-,,,82’)7个单位补体对照$不溶血#红细胞对照$不溶血#’2!2!!阳性判定$一般被检血清稀释3D4以上%包括3D4&达到78C抑制溶血时判为阳性#’2!2#!阴性判定$一般被检血清稀释3D4小于78C抑制溶血时判为阴性#4!!#!##!$附!录!%%资料性附录&溶血素效价的确定图%2%!溶血素效价的测定7!!#!##!$附!录!&%资料性附录&补体效价的确定图&2%!补体效价的确定’!!#!##!$附!录!’%规范性附录&抗原效价测定表表’2%!方阵试验项!!目抗原稀释度3’43’(3’3’3’0)3’’43’3)(3’)7’3’73)血清对照抗原对照补体对照红细胞对照抗原’#)7)7)7)7)7)7)7)7,)7,,阳性对照血清’#3’4)7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,3’()7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,3’3’)7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,3’0))7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,3’’4)7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,3’3)()7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,3’)7’)7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,3’73))7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,3’38阴性对照血清’#)7)7)7)7)7)7)7)7)7,,,补体工作效价’#)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7,稀释液’#,,,,,,,,)7)778;7第一次感作0;5振荡489@*致敏红细胞’#)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7)7第二次感作0;5振荡089@*!!注$抗原对照为388C溶血补体对照为388C溶血红细胞对照为不溶血血清对照为388C溶血时试验成立#!!#!##!$书书书!!#!##!$附!录!$!规范性附录标准比色孔的配制$!%!制备血红素$!%!%!取#绵羊红细胞$!%&’#加入到$(!%&’蒸馏水中#充分破解$$!%!!!加入)!*%#氯化钠!+,-.!(&’