可溶性糖测量方法

实验12植物组织中可溶性糖含量的测定在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH3的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620nm，故在此波长下进行比色。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物鲜样或干样。（二）试剂1.80％乙醇。2.葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释10倍（100μg/mL）。3．蒽酮试剂：称取1.0g蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2～3周。（三）仪器设备分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（5、1、0.5mL），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。三、实验步骤1.样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5～1.0g（或干样粉末5～100mg），放入大试管中，加入15mL蒸馏水，在沸水浴中煮沸20min，取出冷却，过滤入100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。2.标准曲线制作取6支大试管，从0～5分别编号，按表24-1加入各试剂。表24-1蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量试剂管号012345100μg/mL葡萄糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20蒽酮试剂（mL）5.05.05.05.05.05.0葡萄糖量（μg）020406080100将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10min，取出冷却，在620nm波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（μg）为横坐标绘制标准曲线。3．样品测定取待测样品提取液1.0mL加蒽酮试剂5mL，同以上操作显色测定光密度。重复3次。四、结果计算式中：C——从标准曲线查得葡萄糖量，μg。VT——样品提取液总体积,mL。V1——显色时取样品液量，mL。W——样品重（g）。Ⅱ苯酚法测定可溶性糖一、原理植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料新鲜的植物叶片。（二）试剂1.90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水溶解并定容至100mL，在室温下可保存数月。2.9％苯酚溶液：取3mL90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。3.浓硫酸（比重1.84）。4.1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g，加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。5.100μg/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液lmL加入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容。（三）仪器设备分光光度计，电炉，铝锅，20mL刻度试管，刻度吸管5mL1支、lmL2支，记号笔，吸水纸适量。三、实验步骤1．标准曲线的制作取20mL刻度试管11支，从0～10分别编号，按表24–2加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5～20s时间加入5mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8mL，在室温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。表24-2苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量试剂管号01、23、45、67、89、10100μg/L蔗糖标准液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）2.01.81.61.41.21.0蔗糖量（μg）0204060801002．可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.1～0.3g,共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5～10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，计算测试样品中糖含量。四、结果计算可溶性糖含量（％）=式中：C——标准方程求得糖量，μg。VT——提取液体积，mL。V1——吸取样品液体积，mL。W——组织重量，g。Ⅲ3，5–二硝基水杨酸比色法测定还原糖一、原理3，5–二硝基水杨酸溶液与还原糖（各种单糖和麦芽糖）溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅的程度成一定比例关系。在540nm波长下测定棕红色物质的消光度值，查标准曲线，便可求出样品中还原糖的含量。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料食用面粉。（二）试剂1.1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘干至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，置冰箱中保存备用。2.3,5-二硝基水杨酸试剂：3,5-二硝基水杨酸6.3g，2mol/L的NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。（三）仪器设备离心机，电子天平，分光光度计，大离心管或玻璃漏斗，100mL烧杯，100mL三角瓶，刻度试管，刻度吸管1、2、10mL，沸水浴，容量瓶。三、实验步骤1.制作葡萄糖标准曲线取7支具有25mL刻度的刻度试管，编号，按表24–3所示的量，精确加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液和3,5–二硝基水杨酸试剂。表24-3绘制葡萄糖标准曲线的试剂量试剂管号01234561mg/mL葡萄糖标准液（mL）00.20.40.60.81.01.2蒸馏水（mL）2.01.81.61.41.21.00.83,5–二硝基水杨酸试剂（mL）1.51.51.51.51.51.51.5相当于葡萄糖量（mg）00.20.40.60.81.01.2将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5mL蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线，求得直线方程。2.样品中还原糖的测定（1）样品中还原糖的提取准确称取3g食用面粉，放在100mL的烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20mL蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在l00mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）显色和比色取3支25mL刻度试管，编号，分别加入还原糖待测液2mL，3，5–二硝基水杨酸试剂1.5mL，其余操作均与制作标准曲线相同，测定各管的消光值。分别在标准曲线上查出相应还原糖毫克数，计算还原糖百分含量。四、结果计算式中：C——标准曲线方程求得的还原糖量，mg。VT——提取液的体积，mL。V1——显色时吸取样品液体积，mL。W——样品重，g。Ⅳ斐林试剂比色法测定还原糖一、原理植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的Cu2+还原成Cu+，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比，在590nm波长下比色测定吸光度，查标准曲线，即可计算出所测样品中还原糖的含量。本方法也可用于测定蔗糖及总糖含量。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。（二）试剂1.斐林试剂A液：40gCuSO4·5H2O溶解于蒸馏水定容至1000mL。2.斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·5H2O）与150gNaOH溶于蒸馏水中，并定容至1000mL。A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。3.0.1％葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100mL。4.0.1mol/LNaOH。5.甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于250mL60％乙醇中。6.10％Pb(Ac)2。7.饱和Na2SO4。（三）仪器设备分光光度计，分析天平，离心机，水浴锅，具塞刻度试管，刻度吸管，容量瓶，研钵。三、实验步骤1.标准曲线的制作取7支试管，按表24–4分别加入各溶液。表24-4还原性糖测定时绘制标准曲线的试剂量试剂管号01234560.1％葡萄糖标准液（mL）0123456蒸馏水（mL）6543210每管含葡萄糖量（mg）0123456斐林试剂（mL）4444444将以上各管混合后加塞，于沸水浴中加热15min。取出后自来水冷却，1500r/min离心15min。取上清液，用分光光度计在590nm波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度。用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品中还原糖的提取取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取3.00g，放入研钵中研磨至糊状，用水洗入大试管中。体积为10～15mL时，加2～3滴甲基红指示剂，如呈红色，可用0.1mol/L的NaOH中和至微黄色。若用风干样品，可称取干粉3.00g，先在烧杯中用少量水湿润，然后用水洗入250mL容量瓶中，如显酸性，可用上法中和。将大试管置于80℃的恒温水浴中保温30min，其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品，此间可加10％Pb(Ac)2，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和Na2SO4除去多余的铅离子。30min后取出冷却，将提取液全部转入100mL容量瓶中。定容至刻度，摇匀后过滤待测。3.样品测定吸取6mL待测液，加4mL斐林试剂，其他操作与标准曲线相同，在590nm波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量。四、结果计算式中：C——标准曲线方程求得