SCT 7214.1-2011 鱼类爱德华氏茵检测方法 第1部分迟缓爱德华氏茵

ICS11.220B41中华人民共和国水产行业标准SC／T7214.1—2011鱼类爱德华氏茵检测方法第1部分：迟缓爱德华氏茵DetectionmethodsforEdwardsiellafromfish—Part1：Edwardsiellatarda2011-09-01发布2011-12-01实施华国农业中人民共和部发布SC／T7214.1—2011前言SC／T7214—2011《鱼类爱德华氏菌检测方法》分为3部分：——第1部分：迟缓爱德华氏菌；——第2部分：鲴爱德华氏菌；——第3部分：保科爱德华氏菌。本部分为SC／T7214—2011的第1部分。本标准按照GB／T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC／TC156)归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所。本部分主要起草人：赵飞、姜兰、邹为民、谭爱萍、陆小萏、罗理、王伟利。ⅠSC／T7214.1—2011鱼类爱德华氏菌检测方法第1部分：迟缓爱德华氏菌1范围本部分规定了鱼类迟缓爱德华氏菌的采样程序、细菌鉴定方法与结果判定指标。本部分适用于鱼类迟缓爱德华氏菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB／T4789.28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB／T6682分析实验室用水规格和实验方法GB／T18652致病性嗜水气单胞菌检验方法SC／T7014—2006水生动物检疫实验技术规范3试剂、染色液与培养基检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按GB／T4789.28、GB／T18652或SC／T7014中的规定执行；聚合酶链式反应(PCR)测定用水应符合GB／T6682中一级水的规格，且要用焦炭酸二乙酯(DEPC)处理水(A．1)，上述未提及的见附录A。16SrRNA基因DNA序列扩‘增引物，P1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P2：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，-20℃保存。4设备和器械超净工作台、生物显微镜、PCR仪、电泳仪、微生物检测必备辅助设备和器械等。5细菌分离与培养5.1取样取鱼的肝、肾及病灶组织。从取样组织中直接分离接种；在无菌环境中将样品置于无菌离心管中，用无菌盐水冲洗并捣碎，然后分离接种。5.2分离培养样品接种在血液琼脂平板（按GB／T4789.28—2003中4.6规定的方法配制），按常规法划线。28℃培养24h～48h。然后，从中挑取灰白色、圆形、湿润、呈半透明状的单菌落在普通营养琼脂平板（按GB／T4789.28—2003中4.7规定的方法配制）进行纯化培养。6革兰氏染色按GB／T4789.28—2003中2.2的规定执行。1SC／T7214.1—20117生理生化试验7.1硫化氢试验按GB／T4789.28—2003中3.14的规定执行。培养基变黑色为阳性，不变黑色为阴性。7.2运动性试验半固体琼脂按GB／T4789.28—2003中4.30的方法配制。把待检菌穿刺接种于半固体琼脂，28℃培养24h。若待检菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；若待检菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。7.3氧化酶试验以毛细管吸取四甲基对苯二胺的1%水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性，不变色为阴性。7.4丙二酸盐利用试验按GB／T4789.28—2003中3.7的规定执行。培养基由绿色变为蓝色为阳性，不变蓝色为阴性。7.5吲哚试验按SC／T7014—2006表2的吲哚（靛基质）试验的规定执行。培养基变红色为阳性，不变红色为阴性。7.6甲基红(M．R)试验按SC／T7014—2006表2的甲基红(M．R)试验的规定执行。培养基变红色为阳性，不变红色为阴性。7.7赖氨酸脱羧酶试验按GB／T4789.28—2003中3.12的规定执行。试验管培养基呈紫色、对照管培养基呈黄色为阳性，试验管培养基不呈紫色、对照管培养基呈黄色为阴性。7.8β-半乳糖苷酶(ONPG)试验按GB／T4789.28—2003中3.3的规定执行。培养基变黄色为阳性，不变黄色为阴性。7.9糖、醇类（D-葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-甘露醇）发酵试验将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（配制方法见A.2），28℃培养24h后观察。培养基变黄色为阳性，不变黄色为阴性。816SrRNA基因DNA的序列测定和同源性分析试验8.1DNA提取8.1.1将5.2分离纯化的待检菌接种于普通营养液体培养基中，以28℃摇床培养24h。8.1.2取2mL待检菌培养液，12000r／min离心1min，收集菌体。8.1.3菌体悬浮于500µLTE缓冲液(pH8.0)(A．3)，振荡悬浮，加入50µL10%的SDS溶液(A．4)，10µL20mg／mL的蛋白酶K(A．5)，混匀，37℃温育1h。8.1.4加入100µL5mol／L的NaCl溶液(A．6)，充分混匀，再加入100µLCTAB／NaCl溶液(A．7)，混匀，65℃温育20min。8.1.5加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(A．8)，混匀，12000r／min离心5min。8.1.6取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)(A．9)，混匀，12000r／min离心5min。8.1.7取上清液，加入1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，10000r／min离心10min;沉淀用70%酒精洗涤2次，室温晾干。8.1.8加入50µL的TE缓冲液溶解，-20℃贮存，备用。2SC／T7214.1—20118.216SrRNA基因DNA序列扩增8.2.1在PCR管中加10×PCR缓冲液（无Mg2+）5.0µL，MgCl2(25mmol／1)5.0µL，dNTPs(10mmol／L)1.0µL，引物(20pmol／L)P1和P2各1.0µL，TaqDNA酶(5U／µL)0.5µL，DNA模板1.0µL，无菌双蒸水35.5µL。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。如果使用无热盖的PCR扩增仪，需在反应混合物上覆加2滴矿物油。混匀后，3000r／min离心30s。8.2.2将反应管置于PCR扩增仪，按下列程序进行PCR扩增：94℃预变性2min;94℃变性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸7min；4℃保温。8.3琼脂糖凝胶电泳8.3.1用TAE电泳缓冲液(A．10)配制1%的琼脂糖（含0.5µg／mLEB或相应浓度的EB替代品）平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述6µL样品和2µL溴酚蓝指示剂溶液(A．11)加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。8.3.2120V电泳约20min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察电泳条带的数量和位置。8.3.3在长波紫外灯下用刀片切下含有目的条带(约1500bp)的胶块，放人无菌离心管中称重。8.4PCR扩增产物纯化、测序及序列比对8.4.1PCR扩增产物纯化8.4.1.1按每0.1g琼脂糖凝胶加0.1mL酚，将酚加入8.3.3含有目的条带胶块的离心管中。8.4.1.2经漩涡混匀器振荡1min～2min，将离心管在-70℃放置1h，使凝胶完全冻结。8.4.1.337℃水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡混匀器上振荡1min～2min;14000r／min离心5min。8.4.1.4取上层水相转入另一离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(A．8)，混匀，12000r／min离心5min。8.4.1.5取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)(A．9)，混匀，12000r／min离心5min。8.4.1.6向收集的水溶液中加入1／10体积的3mol／L的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，置-20℃过夜或-70℃放置1h～2h。8.4.1.714000r／min离心10min，弃上清。8.4.1.8将沉淀的DNA溶于适当体积的TE缓冲液中，置-20℃保存，待测。8.4.2将8.4.1纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列(附录B)进行比对分析。9结果判定9.1菌落形态28℃培养24h～48h，形成圆形、隆起、灰白色、湿润并带有光泽、呈半透明状的菌落。9.2细菌染色革兰氏染色为阴性。9.3生理生化反应试验生理生化反应试验见表1。表1反应项目结果反应项目结果反应项目结果反应项目结果硫化氢＋运动性＋氧化酶-丙二酸盐利用-吲哚＋甲基红＋赖氨酸脱羧酶＋β-半乳糖苷酶-D-葡萄糖＋蔗糖-L-阿拉伯糖-海藻糖-D-甘露醇-3SC／T7214.1—20119.416SrRNA基因DNA的序列测定和同源性分析试验测定的16SrRNA基因DNA序列与附录B所列的基因序列比较，同源性达98%以上。10综合判定符合以下所有特征者判定为迟缓爱德华氏菌：——菌落形态和细菌染色观察与9.1和9.2相符；——生理生化反应结果与9.3相符；——16SrRNA基因DNA的序列测定和同源性分析结果与9.4相符。4SC／T7214.1—2011附录A（规范性附录）培养基和试剂配制方法A．1焦炭酸二乙酯(DEPC)处理水0.1%DEPC处理一级水(GB／T6682)，剧烈震荡后，放置数小时，121℃，30min灭菌除去DEPC，分装。A．2糖、醇类发酵培养基蛋白胨2gNaCl5gK2HP040.2g被测糖或醇类10g琼脂6g溴百里酚蓝1%水溶液3mL（溴百里酚蓝先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%的水溶液）蒸馏水1000mLpH7.0～7.2，分装试管，培养基高度约4.5cm，115℃灭菌20min。A．3TE缓冲液(pH8.0)将0.121gTris碱（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温保存。A．410%SDS溶液将10g十二烷基硫酸钠加入80mL双蒸水中，加热至68℃助溶，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。A．5蛋白酶K(20mg／mL)将蛋白酶K溶解于双蒸水中，至终浓度20mg／mL，分装入小管，置-20℃保存。A．65moI／LNaCI溶液将29.22gNaCl(分子量58.44)溶解于80mL双蒸水中，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。A．7CTAB／NaCI溶液4.1gNaCl溶解于80mL双蒸水中，缓慢加入10gCTAB，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。A．8酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE缓冲液，置4℃保存。5SC／T7214.1—2011A．9氯仿：异戊醇(24：1)将24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中。A．1050×TAE电泳缓冲液在400mL双蒸水中溶解121gTris碱，加入28.55mL冰乙酸和50mL0.5mol／LEDTA，再加双蒸水定容至500mL，室温保存。A．11溴酚蓝指示剂溶液（6×上样缓冲液）溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。6SC／T7214.1—20117