DB14∕T 1510-2017 玉米镰孢穗腐病抗性鉴定牙签接种技术规程

ICS65.020.20B05DB14山西省地方标准DB14/T1510—2017玉米镰孢穗腐病抗性鉴定牙签接种技术规程点击此处添加标准英文译名点击此处添加与国际标准一致性程度的标识文稿版次选择2017-12-10发布2018-02-10实施山西省质量技术监督局发布DB14/T1510—2017I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14菌种分离..........................................................................25菌种繁殖..........................................................................26接种..............................................................................37田间管理..........................................................................38病情调查..........................................................................39抗性评价..........................................................................4附录A（资料性附录）玉米镰孢穗腐病病原..............................................5附录B（资料性附录）玉米镰孢穗腐病相关病菌的分子检测................................7DB14/T1510—2017II前言本标准根据GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西农业大学提出并归口。本标准起草单位：山西农业大学农学院。本标准主要起草人：张作刚、王建明、李新凤、高俊明、胡春艳、曹挥、王春伟、王燕。DB14/T1510—20171玉米镰孢穗腐病抗性鉴定牙签接种技术规程1范围本标准规定了玉米镰孢穗腐病抗性鉴定牙签接种的菌种分离、菌种繁殖、接种、田间管理、病情调查及抗性评价。本标准适用于栽培玉米（ZeamaysL.）自交系、杂交种、群体、开放授粉品种以及野生玉米和玉米近缘种对玉米镰孢穗腐病抗性的田间鉴定和评价。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1248.8玉米抗病虫性鉴定技术规范第8部分：镰孢穗腐病。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1镰孢穗腐病由串珠镰孢（Fusariumverticillioides）、禾谷镰孢（Fusariumgraminearum）等镰孢菌侵染而引起的玉米雌穗部分或全部籽粒及穗轴腐烂的病害。3.2带菌牙签上面长有接种用菌种的牙签。3.3牙签接种将带菌牙签接种于植物适宜的部位。3.4级别定量植物个体或群体发病程度的数值化描述。3.5DB14/T1510—20172抗性评价根据采用的技术标准判别植物寄主对特定病虫害反应程度和抵抗水平的描述。4菌种分离4.1分离以常规组织分离法从发病玉米籽粒中分离穗腐病致病镰孢菌。分离物经形态学鉴定确认为镰孢菌(Fusariumsp.)后，进行分离物的单孢纯化。4.2致病性测定通过玉米穗部接种或幼苗根系接种明确分离物致病性。将发病的组织再分离培养，分离物再通过形态学方法，必要时结合现代分子生物学技术确定其种类。5菌种繁殖5.1菌种准备无菌条件下将病原镰孢菌接种在直径9cm培养皿中的PDA平板培养基上，25℃恒温培养7~8d，菌种长满平板后冷藏待用。5.2麦粒准备将100g麦粒放300mL三角瓶中，清水浸泡12h~24h，中间冲洗1~2次，待麦粒吸足水后，再用清水冲洗2~3次，然后篦去三角瓶中的水，盖上棉塞，待灭菌。5.3牙签准备5.3.1洗煮牙签将牙签在清水中浸泡12h~24h，用清水冲洗后在锅中用清水煮10min~15min，倒掉煮水后再用清水冲洗2~3次。5.3.2渗入营养将清水洗煮过的牙签放在锅中，加清水浸过牙签，然后每1000mL清水再加入200g去皮马铃薯小块和15g~20g葡萄糖制成营养液，一起煮20min~30min。5.3.3沾拌面粉将营养液中煮过的牙签捞出，趁牙签表面湿润时随即放入加有1%琼脂粉的小麦面粉中，搅拌使牙签表面均匀地沾满面粉。每800~1000根牙签需用小麦面粉30g~50g。5.3.4牙签装袋将沾满面粉的牙签轻放在菌袋中，使牙签之间保持一定的空隙，装满后扎住菌袋口，做成牙签菌袋。每袋装800~1000根牙签。5.4高压灭菌DB14/T1510—20173将牙签菌袋与准备的麦粒高压蒸汽灭菌20min。5.5麦粒拌菌无菌条件下，先用接种针或接种环将所准备菌种的菌丝体和培养基一起划碎，再将其接入灭菌的麦粒中，摇动三角瓶使菌种与麦粒混均，做成带菌麦粒。100g麦粒接一培养皿平板菌种。5.6菌袋接种无菌条件下，将带菌麦粒倒入灭菌的菌袋牙签中，扎住袋口，轻轻地上下左右翻动菌袋，使菌种充分粘着到牙签上以及麦粒均匀分散在牙签之间的缝隙中。每800~1000根牙签需用带菌麦粒30g~50g。5.7培养保存将接种后的牙签菌袋在25℃温度下培养7~10d，待牙签表面长满了菌丝，即完成带菌牙签的培养。暂时不用，可将菌袋放4℃条件下冷藏保存。6接种6.1接种时期玉米吐丝10～15d，即乳熟期接种。6.2接种方法先用直径3mm金属锥子或钻头在雌穗中下部较粗的部位稍斜向上径向钻孔，孔深达穗轴中部，然后插入2根带菌牙签。7田间管理玉米接种后，按玉米正常管理要求进行田间管理。8病情调查8.1调查时间玉米生理成熟后。8.2调查记载将接种雌穗剥开苞叶，逐穗估测病部面积占总面积的百分比，按病情分级标准记载各穗的病情级别，计算出每份鉴定材料的平均病情级别。雌穗病情级别分级标准如表1。雌穗发病面积的模拟图如图1,图左为经花丝通道接种后的发病模拟，图右为苞叶穿刺接种后的发病模拟.DB14/T1510—20174表1玉米穗腐病病情级别划分病情分级描述1发病面积占雌穗总面积0～1%3发病面积占雌穗总面积2%～10%5发病面积占雌穗总面积11%～25%7发病面积占雌穗总面积26%～50%9发病面积占雌穗总面积51%～100%图1玉米雌穗发病面积模拟图（仿Reidetal.1996）9抗性评价依据每份鉴定材料的平均病情级别确定其抗病级别，划分标准见表2。当设置的感病对照材料（B73）发病平均级别≥5.6时，该批次鉴定视为有效。对重复鉴定结果，以记载的最高病情级别为最终鉴定结果，并依此结果对鉴定材料进行抗病性评价。表2玉米穗腐病抗性评价标准平均病情级别抗性≤1.5高抗Highlyresistant（HR）1.6～3.5抗Resistant（R）3.6～5.5中抗Moderatelyresistant（MR）5.6～7.5感Susceptible（S）7.6～9.0高感Highlysusceptible（HS）DB14/T1510—20175AA附录A（资料性附录）玉米镰孢穗腐病病原A.1串珠镰孢A.1.1学名A.1.1.1无性态串珠镰孢，学名：Fusarium.moniliformeSheldon，异名：拟轮枝镰孢，F.verticillioides（Sacc.）Nirenberg，OosporaverticillioidesSacc.A.1.1.2有性态串珠赤霉，学名：GibberellamoniliformisWinelandA.1.2形态特征A.1.2.1无性态在PSA培养基上气生菌丝绒状至粉状，白色、淡紫色，有时产生橙色分生孢子座；基物表面紫色；小型分生孢子数量多，卵形、椭圆形；大型分生孢子镰孢形，细长，顶胞渐尖，基胞足跟明显或不明显，隔膜易消解，3～5隔膜，多数3隔膜；3隔孢子大小为（20～42）mm×（3～4.5）mm，5隔孢子大小为（32～54）mm×（3～4.5）mm，厚垣孢子未见；产孢细胞单瓶梗，分枝或不分枝。A.1.2.2有性态子囊壳球形或卵形，表面粗糙，大小为（250～330）mm×（200～280）mm；子囊圆筒形，大小为（90～120）mm×（7～9）mm，内含孢子4～6个，间有8个；子囊孢子椭圆形，双细胞，或3～4个细胞，大小为（14～18）mm×（4.4～7）mm。A.2禾谷镰孢A.2.1学名A.2.1.1无性态禾谷镰孢，学名：FusariumgraminearumClade，异名：FusariumroseumLinkA.2.1.2有性态玉蜀黍赤霉，学名：Gibberellazeae（Schwein.）Petch，异名：Botryosphaeriasaubinetii，Dichomerasaubinetii，Dothideazeae，Gibberasaubinetii，Gibberellaroseum，Gibberellasaubinetii，Sphaeriasaubinetii，SphaeriazeaeA.2.2形态特征DB14/T1510—20176A.2.2.1无性态在PDA培养基上气生菌丝绒状，茂密，白色至淡橙黄色，后期产生橙色分生孢子座，在培养基中产生红色色素。无小型分生孢子；大型分生孢子镰孢形，中等弯曲或略直，顶胞渐尖，基胞足跟明显，5～6隔膜，大小为（40～54）mm×（3～4.5）mm；厚垣孢子间生，单个或串生，无色至浅褐色，长10mm～12mm；产孢细胞单瓶梗，分枝或不分枝。A.2.2.2有性态子囊壳在禾本科植物基质上产生；子囊壳成堆，球形或卵形，表面粗糙，直径140mm～250mm；子囊棒状，大小为（60～85）mm×（8～11）mm，内含孢子8个，间有4～6个；子囊孢子无色，弯曲镰刀状，两端钝圆，3隔，大小为（19～24）mm×（3～4）mm。DB14/T1510—20177BB附录B（资料性附录）玉米镰孢穗腐病相关病菌的分子检测B.1穗腐致病镰孢种的特异性分子检测玉米穗粒上常见镰孢菌种的特异性分子检测引物及扩增片段信息见表B.1。表B.1玉米籽粒上常见镰孢菌种的特异性分子检测信息镰孢菌种引物名称引物序列(5'–3')扩增片段(bp)镰孢菌属Fusariumspp.ItsFAACTCCCAAACCCCTGTGAACATA431ItsRTTTAACGGCGTGGCCGC禾谷镰孢复合种F.graminearumCladeFg16NFACAGATGACAAGATTCAGGCACA280Fg16NRTTCTTTGACATCTGTTCAACCCA串珠镰孢F.verticillioidesVER1CTTCCTGCGATGTTTCTCC578VER2AATTGGCCATTGGTATTATATATCTAB.2禾谷镰孢复合种TEF-1α基因片段扩增禾谷镰孢复合种的TEF-1α基因扩增引物信息：TEF-F(5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3')，TEF-R(5'-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3')。正向引物TEF-F