DB21∕T 2716.1-2016 中间球和光棘球海胆 种质 第1部分 中间球海胆 种质

ICS65.150B51DB21辽宁省地方标准DB21/T2716.1—2016中间球和光棘球海胆种质第1部分中间球海胆种质StrongylocentrotusintermediusandStrongylocentrotusnudusPart1Strongylocentrotusintermedius2016-11-18发布2017-01-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2716.1—2016I前言本标准根据GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由大连市质量技术监督局提出。本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。本标准主要起草单位：大连海洋大学。本标准主要起草人：常亚青、赵冲、湛垚垚、宋坚、张伟杰。本标准于2016年11月18日首次发布。附录A为资料性附录。DB21/T2716.1—20161中间球和光棘球海胆种质第1部分中间球海胆种质1范围中间球和光棘球海胆种质包含两部分,本部分为第1部分中间球海胆种质，本部分规定了中间球海胆（Strongylocentrotusintermedius）的名称与分类、主要形态特征、繁殖、遗传学遗传学特性、分子遗传学特性、检测方法和判定规则。本部分适用于中间球海胆的种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.2—2008养殖鱼类种质检测第2部分：抽样方法。GB/T18654.12—2008养殖鱼类种质检验第12部分:染色体组型分析。3名称与分类3.1学名中间球海胆（Strongylocentrotusintermedius）。3.2分类地位隶属于棘皮动物门（Echinodermata）、游在亚门（Eleutherozea）、海胆纲（Echinoidea）、正形目（Centrochinoida）、球海胆科（strongylocentrotidae）。4主要形态特征4.1外部形态特征壳呈低半球形，体型中等。口面平坦且稍向内凹，反口面隆起稍低，顶部比较平坦。步带区与间步带区幅宽不等，赤道部以上步带区幅宽为间步带区的2/3，两区自口面观接近于圆形的圆润正五边形。体表的色泽变异较大，有绿褐色、黄褐色。大棘针形，短而尖锐，长度为5mm～8mm，在水中管足细长、淡黄透亮。DB21/T2716.1—20162a反口面b口面图1中间球海胆的外部形态4.2内部构造4.2.1口器口器在口面中心，由5个大而尖锐的大齿、5个大齿骨、若干块小齿骨以及与之相连肌肉束组成。4.2.2消化道应分为咽、食道、胃、肠、直肠5部分。食道呈短管状，前端接于咽、后端接于胃。具有与胃相关的虹管。咽和食道内具有粘液细胞。4.2.3神经系统应由表皮神经系、反口极神经系和深在神经系组成。4.2.4管足系统应由步管环、辐步管及其支管、石管、波里氏囊、坛囊和管足组成。4.2.5循环系统应由背血管、腹血管、辐血管、血管环以及分支血管组成。4.2.6生殖腺生殖腺5对，由肠系膜悬挂于各生殖腔间步带内侧，呈纺锤状。4.2.7围口鳃围口鳃5对，常在壳缘处形成鳃裂。5繁殖5.1性成熟年龄与性腺特征DB21/T2716.1—20163雌雄异体，雌雄外观上无区别，生殖腺5对，呈瓣状分布，性成熟年龄为两周年，成熟季节生殖腺色泽淡黄至橙黄色。5.2生物最小型壳径应为3.5cm，因海域和生长状态不同而存在差异。5.3性比性比接近1:1。5.4繁殖期应在辽宁地区9月底至10月中下旬。5.5产卵量壳径在4.5cm～6.8cm的中间球海胆个体产卵量应在10万粒～2000万粒之间。5.6精卵特征沉性卵，卵径为70μm～100μm。精子全长在20μm～30μm之间，分为头部、中段和尾部三部分。6细胞遗传学特性体细胞染色体数目2n=42。7分子遗传学特性中间球海胆线粒体DNACOⅠ基因片段为1056bp，其序列（GenBank序列号：EU003213.1）见附录A。8检测方法8.1抽样应按照GB/T18654的第2部分（抽样方法）的规定执行。8.2形态构造肉眼观察，并结合游标卡尺测量。8.3染色体和核型检测8.3.1染色体标本的制备8.3.1.1应用去核的中间球海胆卵子破碎体与正常的中间球海胆精子制得具有分裂能力的中间球海胆受精卵，取其桑葚期个体若干，浓缩，放于10ml离心管中，加入0.05mol/L的秋水仙素（海水配置）5ml～8ml，静置30min～50min。8.3.1.2用7％-10％柠檬酸钠溶液低渗10min。8.3.1.3卡诺固定液固定3次，每次15min～20min。DB21/T2716.1—201648.3.1.450％冰醋酸解离数分钟,轻轻吹打。8.3.1.550℃温片滴片。8.3.1.6烘干后10％Giemsa染液（pH值6.8）染色30min。8.3.1.7自来水冲洗，自然干燥后镜检。8.3.2核型分析观察100个分散良好的中期分裂相，记数确定二倍体数。应从中挑选10个分散良好、形态清晰的中期分裂相进行显微摄像、放大、测量，染色体分类应按照GB/T18654的第12部分（染色体组型分析）的规定执行。8.4分子遗传学特性8.4.1线粒体COⅠ序列分析——应取中间球海胆管足，剪碎并用蛋白酶K消化后，用试剂盒进行总DNA的抽提。扩增引物为COI-F-5′-ACACTTTATTTGATTTTTGG-3′和COI-R-5′-CCCATTGAAAGAACGTAGTGAAAGTG-3′。反应体系为50μL，每反应体系包括1.25单位的TapDNA聚合酶；各种反应组分的终浓度为200nmol/L的正反向引物；200nmol/L的每种dNTP,10×PCR缓冲液[200mmol/LTris-Hcl,pH8.4;200mmol/LKCl;100mmol/L(NH4)2SO4;15mmol/LMgCl2]5ul,加Milli-QH2O至50ul。基因组DNA20ng。每组PCR均设阴性对照来检测是否污染。PCR参数包括94℃预变性4min，94℃变形40s，52℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，然后72℃后延伸7min。所有PCR均在热循环仪上完成。扩增产物送生工生物工程股份有限公司直接测序，为了保证序列的准确性，对所有样品应进行双向测序。——运用DNAStar软件包进行序列比对，用DNASP和MEGA进行数据分析和处理。9判定规则被检样品应符合本标准中5.1、5.2、7及8规定要求的为本种样本。如果有一项不符合的可以复检，复检不合格的则判定为不是中间球海胆样本，复检合格的判定应为中间球海胆样本。DB21/T2716.1—20165AA附录A（资料性附录）中间球海胆线粒体DNACOⅠ序列（GenBank序列号：EU003213.1）GCTTGAGCTGGAATGGTAGGCACAGCTATGAGTGTGATTATCCGCGCCGAGTTGGCACAACCTGGTTCTCTACTAAAAGACGATCAAATATACAAAGTGGTCGTTACCGCACATGCCCTAGTCATGATTTTTTTTATGGTAATGCCAATAATGATTGGTGGATTTGGAAATTGACTCATTCCACTGATGATCGGTGCACCAGACATGGCCTTTCCTCGGATGAAAAATATGAGTTTTTGGCTCATCCCCCCTTCCTTTATATTACTTTTAGCATCTGCAGGAGTAGAGAGAGGAGCAGGAACTGGCTGAACTATCTATCCCCCTCTCTCTAGTAAAATAGCACACGCCGGTGGATCTGTTGACTTAGCGATCTTTTCCCTCCACCTTGCCGGTGCCTCTTCTATCTTGGCCTCAATTAAATTTATAACAACAATTATTAACATGCGGACACCAGGAATGTCTTTTGACCGTCTTCCTTTATTTGTCTGATCCGTCTTTGTTACCGCGTTCTTGCTCCTCCTTTCTCTTCCAGTCTTAGCAGGAGCAATTACAATGCTCCTCACAGATCGTAAAATAAACACAACTTTCTTCGATCCAGCAGGAGGGGGGGATCCAATTCTGTTCCAACACTTATTCTGGTTTTTTGGTCACCCAGAAGTGTACATTCTTATCTTGCCTGGATTTGGTATGATTTCACACGTTATAGCTCATTACTCTGGTAAGCGGGAGCCTTTTGGATACCTAGGAATGGTTTATGCCATGATTGCAATAGGAGTTTTGGGATTCCTTGTCTGAGCCCATCATATGTTTACGGTAGGAATGGATGTTGATACACGAGCATACTTCACTGCCGCCACGATGATAATTGCTGTTCCAACAGGAATCAAGGTTTTCAGATGAATGGCGACACTCCAGGGGTCTAATCTACAATGAGAGACTCCCTTATTATGAGCCCTGGGATTCGTATTTTTGTTCACGTTAGGGGGACTTACAGGTATTGTTCTCGCCAATTCCTCTATTGACGTTGTTCTTCATGATACCTACTB_________________________________