DB13T 2422-2016 高山杜鹃工厂化育苗技术规程

ICS65.020.40B62DB13河北省地方标准DB13/T2422—2016高山杜鹃工厂化育苗技术规程2016-09-30发布2016-12-01实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2422—2016I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由石家庄市质量技术监督局提出。本标准起草单位：石家庄市农林科学研究院。本标准主要起草人：蒋淑磊、李志斌、李国松、李振勤、白霄霞、徐立军、边光亚。DB13/T2422—20161高山杜鹃工厂化育苗技术规程1范围本标准规定了高山杜鹃工厂化育苗生产的组织培养车间的设计、主要仪器设备、组培生产流程、炼苗移栽、质量分级及包装、标志、运输等内容。本标准适用于高山杜鹃工厂化繁育生产、管理的全过程。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2306-2013花卉种苗组培快繁技术规程。3组培车间与育苗区设计3.1设计要求3.1.1组培车间应建在干燥、通风透光、空气清新的地点。3.1.2组培车间主要包括:洗涤室、药品室（称量室）、培养基配制室、灭菌室、培养基储备室、接种室、培养室等。3.1.3育苗区主要包括炼苗室和温室大棚。3.2面积要求不同规模的高山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求见表1表1不同规模的高山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求单位：m2名称面积指标年产5万株年产10万株年产20万株组培车间200～300370～450700～800洗涤室12～1520～3040～50培养瓶晾干室5～1020～3040～50药品室(称量室)12～1520～3020～30培养基配制室12～1520～3040～60DB13/T2422—20162表1不同规模的高山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求（续）单位：m2名称面积指标年产5万株年产10万株年产20万株灭菌室5～1020～3020～30培养基储存室10～1520～3040～60接种室20～2550～80100～120培养室60～80150～250300～400出苗室20～3020～3040～50育苗区750～9001500～20003000～3500炼苗室15～2020～3030～50温室大棚700～8001000～12002000～30004仪器设备及试剂所需的仪器设备及试剂主要包括：灭菌设备、接种设备、培养设备和组培常规试剂。不同规模高山杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂见表2。表2不同规模高山杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂名称数量指标年产5万株株万株年产10万株万株年产20万株万株灭菌设备、器械50L立式高压灭菌器111360L卧式高压蒸汽灭菌器012干燥灭菌器81632电热干燥箱50cm×60cm×75cm11140W紫外灯若干若干若干接种设备及器械超净工作台（单人）81632酒精灯81632镊子163264手术刀柄163264不锈钢碟80160320培养设备和培养容器空调51020培养架50100200DB13/T2422—20163表2不同规模高山杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂（续）名称数量指标年产5万株株万株年产10万株万株年产20万株万株组培专用托盘150030006000250mL培养瓶6万12万24万其它0.1mg/0～210g电子分析天平1110.01g/0～6000g电子精密天平111pH计111温度计51020200L冰箱123电磁炉122双层小推车51020小型去离子水设备10-100L111试剂WPM基本培养基组成成分试剂和植物生长物质玻璃器皿烧杯、试剂瓶、量筒、容量瓶等5组培生产流程5.1品种选择与母本材料管理5.1.1品种选择选择适应性强，观赏价值高的高山杜鹃品种，例如：粉金蝶（Rhododendronhybridscv'Cosmopolitan'），红粉佳人（Rh.cv.NovaZembla），马缨花（Rh.Fr）。5.1.2母本材料管理将高山杜鹃母本植株种植在特定区域，加强肥水管理，防治和减少植株表面附带的病虫害。5.2培养基选择与母液配制5.2.1培养基选择以WPM和1/2WPM为基本培养基。5.2.2母液的配制制作培养基前需先配制基本培养基母液，WPM培养基母液配制比例见表3。DB13/T2422—20164表3WPM培养基母液配制种类成分称取量（mg）母液体积（ml）配1升培养基吸取量（ml）大量元素NH4NO3(NH4)2SO4MgSO4.7H2OKH2PO4KNO3K2SO44000132037001700400090001000100中量元素镁MgSO4.7H2O37001000100钙CaCl2.Ca(NO3)2·4H2O9605560微量元素螯合铁Na2-EDTAFeSO4.7H2O373027805005H3BO3MnSO4.H2ONa2MoO4·2H2OCuSO4.5H2OZnSO4·7H2O310111512.51.2543050010维生素肌醇烟酸（维生素PP）盐酸吡多醇盐酸硫胺素甘氨酸500025252510050010注：母液配制应用去离子水，置于4℃左右冰箱保存，贴好标签，注明名称、配制日期。5.3植物生长物质的母液配制5.3.1植物生长物质的母液配制浓度1.0mg/ml，植物生长物质的母液配制方法见表4。表4植物生长物质的母液配制方法类别种类常用浓度（mg/ml）细胞分裂素2ip（异戊烯基腺嘌呤）1.0生长素IAA（吲哚乙酸）1.0IBA（吲哚丁酸）1.0NAA（α-萘乙酸）1.0DB13/T2422—201655.3.2配制方法：先用少量0.1mol/L的NaOH溶解，然后加蒸馏水定容。5.3.3保存要求：母液配制好后贴好标签，置于4℃左右的冰箱内，保存期应不超过2个月。5.4培养基制作5.4.1制作取预配母液，加入激素，充分搅拌均匀，用去离子水定容1升，加入琼脂6.5g/L，砂糖30g/L，加热溶解。测pH值，用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调节pH值至5.4～5.6。5.4.2分装根据不同需要定量分装，一般要求占瓶20～25%的比例，分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口，盖好瓶盖。5.5高压灭菌5.5.1分装后的培养基应在10h内通过高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌要求121℃灭菌20min。5.5.2合格的灭菌培养基，应注明灭菌日期，合格标志。5.5.3灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。按培养基种类和配制先后储存于培养基储藏室内。为保证培养基质量，将配制好的培养基放置5d左右观察再用，且贮存时间不应超过一个月。5.6外植体从健壮植株上选取生长饱满的花蕾为外植体；也可采用茎芽为外植体。5.6.1材料预处理将外植体剪取适当大小，用洗涤剂溶液浸泡并振荡5min～10min，然后自来水冲洗30min。5.6.2外植体消毒在超净台上将预处理后的外植体放入有盖容器中，倒入75%酒精使之没过外植体，并轻摇以除去气泡，浸泡30s，倒去酒精，用无菌水冲洗外植体5次。倒入0.1%的HgCl2使之没过外植体，根据外植体材料的质量和大小，在HgCl2溶液中浸泡2min～3min，处理过程中不断轻摇，将外植体表面的气泡除去，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗3～5次后备用。5.7接种准备及外植体接种操作接种准备和外植体接种操作规范按照《花卉种苗组培快繁技术规程》执行。5.8组织培养过程5.8.1培养室条件培养温度为20℃～22℃，光照强度3000lux～3500lux，每日光照12h。5.8.2初代培养基初代培养的培养基配方为:WPM+2ip6.0mg/L+白砂糖30g/L+琼脂6.5g/L，pH值调至5.4～5.6。5.8.3继代培养基DB13/T2422—20166培养1周后，花托基部开始膨大，培养6周后，长出淡黄或浅绿光滑的愈伤组织块，继续转接在WPM+2ip6.0mg/L+白砂糖30g/L+琼脂6.5g/L培养，长出丛生芽。5.9不定芽分化与增殖培养5.9.1不定芽分化与增殖培养基诱导不定芽分化与增殖的培养基配方:WPM+2ip2.0mg/L+NAA0.5mg/L+白砂30g/L+琼脂6.5g/L，pH值调至5.4～5.6。5.9.2丛生芽切割5.9.2.1先打开培养瓶盖，瓶口向内，取出的丛生芽块放于有无菌盘上切割；150mL的培养瓶的增殖培养切芽接种数量5块/瓶。在瓶内排放均匀、整齐。5.9.2.2每取一丛生芽块并完成切割和接种后，将接种盘连同切苗过程中的废弃物放到一大接种盘内，同时更换新的无菌接种盘。5.10组培苗生根将高度为2cm～3cm的丛生苗直接接种于生根培养基中，诱导生根的培养基配方:1/2WPM+IBA4mg/L+IAA0.5mg/L+白砂糖30g/L+琼脂6.5g/L，pH值调至5.4～5.6。在150mL的培养瓶接种数量8株/瓶。生根培养30d后，幼苗基部长出4～7条新根，当根长到3cm～4cm长时，就可进行炼苗移栽。5.11污染防治污染防治方法参见附录A。5.12组培苗质量标准评价组培苗质量标准参考附件B。6炼苗与移栽6.1炼苗：将生根瓶苗从培养室中取出，置于炼苗室中进行自然光适应性锻炼，温度控制在20℃～22℃，经过3～4d的闭口锻炼后，之后打开培养瓶，炼苗5～7d再进入移栽阶段。6.2移栽6.2.1清除培养基从瓶中轻轻取出组培苗，放在室温的温水中，将附着在根上的培养基清洗掉，洗时注意不能伤根，然后放入另一盆加入1%多菌灵杀菌剂的温水中浸泡5min，进行移栽。6.2.2基质准备将0.1mm～0.3mm的珍珠岩与草炭土按照1:3混合装入穴盘中，用细眼喷壶将基质喷湿，使基质含水量达到60%左右。6.2.3移栽在穴盘中挖深度3～4cm，将试管苗的根部顺延下去，用两手边合边压实。DB13/T2422—201676.2.4喷水移栽后用细喷雾器喷水，冲洗叶片上可能粘着的基质，并使根系和基质紧密接触。6.2.5插牌分品种、日期，插牌记录。6.2.6移栽后的管理6.2.6.1保温保湿用薄膜小拱棚保温保湿，保持相对湿度在80%左右，温度保持在18℃～22℃之间。薄膜小拱棚可适时通风0.5h～1h。光照强度控制5000lux～10000lux，当试管苗再生新根后可完全打开薄膜小拱棚，自然光照强度，降低空气湿度至60%左右。6.2.6.2施肥为使试管苗健壮，当试管苗正常生长后，可进行叶面喷肥，喷施1/10MS培养基溶液加0.1%的H2PO4溶液。6.2.6.3病虫防治温室使用前彻底消毒，用硫磺、百菌清烟雾剂熏蒸3-4次，温室使用后经常用福尔马林、来苏水消毒。加强通风，每隔7d喷一次广普性杀菌剂。一旦发现虫害、病害及时药物治疗。6.3移栽苗的质量标准移栽苗的质量标准参见附录C7包装、标志和运输7.1包装当试管苗根系发达、植株健壮、叶片宽度达到10cm左右即可出苗，把穴盘苗装在泡沫盒中，注意留有通气孔。7.2标志每箱应贴上标签，注明品种、等级、规格、数量、产地、出苗日期等。7.3运输装车时切勿倒置，以避免日晒、雨淋，运输途中温度保持10℃～15℃，5d内到达目的地。DB13/T2422—20168附录A（资料性附录）组培污染防治A.1母瓶A.1.1母瓶检查提取母瓶时要仔细检查母瓶是否污染，若发现污染母瓶应立即剔除。A.1.2母瓶预处理按生产计划提取母瓶，表面喷75%的酒精后，用无菌纱布擦净，放于操作台旁备用，接种过程中若发现母瓶污染则立即封口。A.2切割培养皿的取放用无菌镊子从棉布包里取出接种盘放在超净工作台面上，应注意手不能接触盘的边沿。A.3污染检查A.3.1所有污染材料不应在培养室、接种室及中央走廊内开启瓶盖并应在发现当天送到洗涤室。对细菌污染的生根瓶苗可转移到炼苗室移栽。A.3.2对处理情况进行数据记录和简要分析原因，并反馈给操作人员。A.4培养室内清洁、消毒A.4.1每周用75%的酒精溶液作喷雾降尘处理。每周用消毒液抹地板、门窗等。每隔一周用紫外灯或臭氧发生器消毒30min。A.4.2如培养室有通