DB21∕T 2705-2016 淡水养殖用微生物粉剂中硝化细菌总数测定方法

ICS01.120A00DB21辽宁省地方标准DB21/T2705—2016淡水养殖用微生物粉剂中硝化细菌总数测定方法Enumerationofnitrifyingbacteriainmicrobialpowderforfreshwateraquacultureusage2016–10–25发布2016–12–25实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2705-2016I前言本标准是按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草的。本标准由大连民族大学提出。本标准由大连市质量技术监督局归口。本标准起草单位：大连民族大学。本标准主要起草人：赵晶、权春善、金黎明、范圣第。DB21/T2705-20161淡水养殖用微生物粉剂中硝化细菌总数测定方法1范围本标准规定了淡水养殖用微生物粉剂中硝化细菌总数测定的术语和定义、方法提要、试剂和材料、仪器和设备、实验前准备、测定步骤、检测及计数方法。本标准适用于单一菌种成分或复合菌种成分的淡水养殖用微生物粉剂中硝化细菌总数的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1605商品农药采样方法GB/T26322工业循环冷却水中亚硝化菌的测定MPN法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1微生物粉剂Microbialpowder利用酵母菌、放线菌、乳酸菌、光合细菌、芽孢杆菌和硝化细菌单一或复合菌种成分，采用发酵和干燥技术得到的固体菌剂。3.2硝化细菌Nitrifyingbacteria由亚硝化菌和硝化菌两类菌群组成，亚硝化菌能够在有氧条件下将铵根离子氧化为亚硝酸根离子，硝化菌能够在有氧条件下将亚硝酸根离子氧化为硝酸根离子。4方法提要亚硝化菌和硝化菌的判定及总数测定方法按下述方法进行：a)在28ºC～30ºC下，恒温振荡培养试样，自第14d起，采用格里斯试剂定性判断亚硝化菌的存在，溶液呈红色，为阳性反应，反之，为阴性反应；b)在28ºC～30ºC下，恒温振荡培养试样，自第14d起，采用盐酸溶液、对氨基苯磺酸和二苯胺硫酸试剂定性判断硝化菌的存在，溶液呈蓝色，为阳性反应，反之，为阴性反应。定期进行硝化细菌的测定，至前后两次测得的阳性试管数不变，采用MPN法对试样中的硝化细菌进行计数。5试剂和材料5.1亚硝酸钠。DB21/T2705-201625.2七水硫酸镁（MgSO4•7H2O）。5.3四水硫酸锰（MnSO4•4H2O）。5.4磷酸氢二钾。5.5磷酸二氢钠。5.6碳酸钠。5.7硫酸铵。5.8纳他霉素。5.9甲醇。5.10二苯胺。5.11浓硫酸。5.12对氨基苯磺酸。5.13冰醋酸。5.14α-萘胺。5.15浓盐酸。5.16牛皮纸。5.17医用脱脂棉。5.180.22μm的无菌滤膜。6仪器和设备6.1高压蒸汽灭菌器。6.2超净工作台。6.3恒温摇床。6.4烘箱。6.5电子天平：感量0.01g。6.6pH计。6.7酒精灯。6.8容量瓶。6.9刻度吸管：1mL、10mL,最小刻度分别为0.01mL、0.1mL。6.10试管：20mm×200mm。6.11滴管。6.12锥形瓶。6.13磨口试剂瓶。6.14烧杯。6.15量筒。6.16白色比色瓷板。6.17药匙。7实验前准备7.1计数培养基制备7.1.1溶液a配制称取亚硝酸钠1g、七水硫酸镁0.03g、四水硫酸锰0.01g于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7.2，蒸馏水定容至500mL，装于2L锥形瓶中，塞上棉塞，用牛皮纸封住瓶DB21/T2705-20163口。7.1.2溶液b配制称取硫酸铵2g、七水硫酸镁0.03g、四水硫酸锰0.01g于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7.2，蒸馏水定容至500mL，装于2L锥形瓶中，塞上棉塞，用牛皮纸封住瓶口。7.1.3溶液c配制称取磷酸氢二钾0.75g、磷酸二氢钠0.25g、碳酸钠1g于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7.2，蒸馏水定容至498mL，装于1L锥形瓶中，塞上棉塞，用牛皮纸封住瓶口。7.1.4纳他霉素储液配制称取50mg纳他霉素溶于10mL甲醇，用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，置于无菌试管中。7.1.5硝化菌计数培养基制备溶液a和溶液c分别置于高压蒸汽灭菌器121ºC灭菌20min，取出冷却至室温。在无菌条件下，将溶液a、溶液c和纳他霉素储液2mL混合均匀，每支无菌试管中加入5mL混合溶液。7.1.6亚硝化菌计数培养基制备溶液b和溶液c分别置于高压蒸汽灭菌器121ºC灭菌20min，取出冷却至室温。在无菌条件下，将溶液b、溶液c和纳他霉素储液2mL混合均匀，每支无菌试管中加入5mL混合溶液。7.2无菌蒸馏水制备7.2.1将蒸馏水装入锥形瓶中，装液量不超过瓶容积三分之二，塞上棉塞，用牛皮纸封住瓶口，置于高压蒸汽灭菌器121ºC灭菌20min。7.2.2每支试管中加入9mL蒸馏水，塞上棉塞，用牛皮纸封住试管口，置于高压蒸汽灭菌器121ºC灭菌20min。7.3刻度吸管灭菌7.3.1将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，长度约10mm～15mm。7.3.2每支刻度吸管用一条约40mm～50mm宽的牛皮纸条，螺旋形卷起，粗端打结固定，置于高压蒸汽灭菌器121ºC灭菌20min，取出后放于烘箱中烘干。7.4采样药匙及试管灭菌7.4.1将洗净并烘干的药匙用牛皮纸包好，扎紧，用高压蒸汽灭菌器121ºC灭菌20min，取出后置于烘箱中烘干。7.4.2将洗净并烘干的试管塞上棉塞，用牛皮纸封住试管口，置于高压蒸汽灭菌器121ºC灭菌20min，取出后置于烘箱中烘干。7.5二苯胺硫酸试剂的制备称取二苯胺1.0g，溶于100mL浓硫酸中，存于棕色瓶中备用，溶液应无色，变色不应再使用。7.6格里斯试剂的制备10%乙酸溶液：冰醋酸10mL与90mL蒸馏水混合均匀。DB21/T2705-20164溶液a：称取对氨基苯磺酸0.5g，溶于150mL的10%乙酸溶液中,存于棕色试剂瓶内。溶液b：称取α-萘胺0.1g溶于20mL蒸馏水中，缓慢加入10%乙酸溶液150mL，混合均匀，存于棕色试剂瓶内。7.7盐酸溶液的制备浓盐酸与蒸馏水1:1（v/v）混合均匀。8测定步骤8.1采样采样方式按照GB/T1605执行。采取样品具有代表性，样品采集后应立即进行检验。8.2试样制备以十倍梯度稀释法稀释试样，应在超净工作台内的酒精灯火焰区进行操作。用无菌药匙称取微生物粉剂10g，加入盛有无菌蒸馏水的锥形瓶中，混合均匀，再用容量瓶将混合溶液定容至100mL。利用容量瓶和锥形瓶反复倾倒，直至容量瓶上无粉剂粘附。锥形瓶振摇30min，即为稀释度为10-1的试样。用无菌刻度吸管取1mL稀释度为10-1的试样，注入含有9mL无菌蒸馏水的试管中，充分摇匀，即为稀释度为10-2的试样。以此类推。8.3试样接种及培养将梯度稀释的试样接种于装有5mL计数培养基的试管中，每管接种1mL，每个稀释度重复接种3管～5管，每接种一个稀释度应更换一支无菌吸管。另取一组试管不接入稀释液，作为空白对照。试管置于28ºC～30ºC摇床中振荡培养，摇床转速为150rpm。9检测及计数9.1亚硝化菌检测取5滴培养液于白色比色瓷板凹孔中，依次加入格里斯(Griess)试剂a液和b液各2滴，搅拌均匀。溶液呈红色，表示有亚硝化菌存在，以“+”(阳性)表示；反之，表示无亚硝化菌存在，以“-”(阴性)表示。9.2硝化菌检测取5滴培养液于白色比色瓷板凹孔中，加入盐酸溶液4滴使其酸化，加入对氨基苯磺酸0.05g搅拌反应5min，再加入2滴～3滴二苯胺硫酸试剂。溶液呈蓝色，表示有硝化菌存在，以“+”（阳性）表示；反之，表示无硝化菌存在，以“-”（阴性）表示。9.3空白对照出现阳性反应，说明测定过程中有污染，本次测定无效。9.4自14d起定期对所有重复接种试管进行亚硝化菌和硝化菌的检测，至前后两次测得的阳性试管数不变，计算出梯度稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。阳性组合指数的计算方法如下：a)梯度稀释中多于3个稀释度时，阳性组合指数只需要用其中依次的3个稀释度，对这3个稀释度的选择应先选出3管全部阳性反应的最大稀释度，再选出其次相连的2个更高的稀释度，计算出阳性组合指数，详见表1中示例1、示例2、示例4；b)若按照上述选出3个稀释度后，有更高的稀释仍然产生1个阳性试管，应将这一阳性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中，详见表1中示例3。DB21/T2705-201659.5采取最大或然数（MPN）法对样品中硝化细菌进行计数。根据阳性组合指数，按GB/T26322附录A、附录B、附录C得出最大可能菌数，用最大可能菌数除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数，得出每克微生物粉剂样品中亚硝化菌和硝化菌总数。报告方式详见表1。表1计数方法示例稀释度、生长情况及阳性试管数示例10-110-210-310-410-5阳性组合指数报告方式个/g1+++3+++3+--1---0---03104.5/10-2=4502+++3++-2+--1---0---032115.0/10-1=1503+++3++-2+--1+--1---032220.0/10-1=2004+++3+++3+++3---0---03002.5/10-3=2500注：以每个稀释度重复接种3管为例