DB21∕T 2589-2016 东部白松种源相关序列多态性(SRAP)分子鉴定实验方法

ICS65.020.40B64DB21辽宁省地方标准DB21/T2589—2016东部白松种源相关序列多态性（SRAP）分子鉴定实验方法TechnicalregulationsofmolecularidentificationmethodfordifferentprovenancesofPinusstrobuswithSRAP2016-03-18发布2016-05-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2589—2016I目次前言...............................................................................III1适用范围..........................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14原理..............................................................................15仪器和设备........................................................................16引物..............................................................................27试剂与溶液........................................................................28实验程序..........................................................................29分析和鉴定........................................................................5附录A（规范性附录）..................................................................6附录B（规范性附录）..................................................................7附录C（规范性附录）..................................................................9附录D（规范性附录）.................................................................10附录E（资料性附录）.................................................................11参考文献............................................................................12DB21/T2589—2016II前言本标准依据GB/T1.1-2009的规则起草。本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录，附录E为资料性附录。本标准由辽宁省林业厅提出并归口。本标准起草单位：辽宁省林业科学研究院。本标准主要起草人：陈罡，冯健，王骞春，魏忠平，叶景丰，马冬菁，白丽萍，刘平，刘怡菲，孟凡金，田永霞，张素清，陈阿梅，谭桂清，王丹，房春果，杨长明，李国军，丁彪，李玉铎，佟帅，王显军，侯燕倢，高英旭。本标准首次发布。DB21/T2589—20161东部白松种源相关序列多态性（SRAP）分子鉴定实验方法1适用范围本标准规定了东部白松种源分子鉴定的实验方法。本标准适用于利用相关序列多态性（SRAP）法对东部白松种源鉴定的实验过程。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写3术语和定义以下术语和定义适用于本标准。3.1相关序列多态性sequence-relatedamplifiedpolymorphism;SRAP利用一对引物对开放阅读框（openreadingframes，ORFs）进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔序列长度不等而产生多态性。3.2聚合酶链式反应polymerasechainreaction;PCR在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异扩增待定DNA序列的方法。3.3引物扩增多态性primeramplifiedpolymorphism一对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数目不同或长度不同的DNA片段。4原理通过一对SRAP引物对东部白松基因组DNA进行扩增。正向引物（F-primer）含有17个碱基，对外显子进行特异扩增；反向引物（R-primer）含有18个碱基，对内含子区域、启动子区域进行扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。最终通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异的多态性片段分离开来，通过比较待测种源和对照品种源DNA指纹谱带数据的差异，来判断待测种源与对照种源是否为相同种源。5仪器和设备5.1PCR扩增仪。DB21/T2589—201625.2琼脂糖凝胶电泳系统。5.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。5.4凝胶成像系统和照相系统。5.5超纯水系统。5.6低温高速冷冻离心机。5.7超微量紫外/可见分光光度计。5.8高压灭菌锅。5.9液氮罐。5.10超低温冰箱。5.11高压电泳仪及配套电泳槽。5.12移液器（枪）。6引物引物相关信息见附录A。7试剂与溶液7.1主要常规试剂见附录B。7.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂见附录C。7.3银染试剂见附录D。8实验程序8.1实验材料选用东部白松新鲜针叶为材料提取基因组DNA。选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置于超低温冰箱中，-70℃保存备用。8.2DNA的提取8.2.1取0.5g洗干净的针叶，用灭菌剪刀剪成小段置1.5mL离心管中(约至0.1刻度线)。加适量PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和VC（抗坏血酸），向离心管中加入液氮后用塑料研磨杵将针叶研磨成粉末。8.2.2加入1ml0℃预冷的CTAB-free提取液，混匀，0℃冰浴10min，期间轻轻颠倒2-3次，在4℃下10000r/min离心10min，弃上清液。若上清液黏稠，用CTAB-free提取液清洗一次。8.2.3加入650μL65℃预热的4×CTAB提取液，用无菌枪头小心将其混匀，65℃水浴30min。8.2.4加入等体积的氯仿:异戊醇(V:V)=24:1的抽提液，轻轻颠倒离心管10min，使其混匀，10000r/minDB21/T2589—20163离心10min，然后用去尖的移液器吸头小心吸取450μL上清液至另一离心管中。重复步骤7.1.41-2次，至白色中间层消失为止。8.2.5加入2倍体积的冰冷（0℃以下）无水乙醇，颠倒混匀，出现絮状沉淀，-20℃放置2h。10000r/min离心10min，弃上清液。8.2.670%乙醇清洗2遍，风干后加入100μL灭菌TE缓冲液溶解沉淀。8.3DNA浓度的检测和定量用TE缓冲液配制lμg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的λ-DNA分子量标准，各取3μLλ-DNA分子量标准溶液和3μL步骤8.2中提取的未知浓度DNA溶液，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，稳压90V，电泳缓冲液为1×TBE，325nm紫外灯下观察，照相，通过与标准溶液的荧光进行比较估测未知DNA的浓度。将步骤7.1中提取的DNA溶液取10μL后，在1.5mL中用TE稀释200倍，放入石英比色杯中，用紫外分光光度计检测，记下其在260nm和280nm的光密度值（OD值），按公式（1）计算出DNA的浓度及OD260和OD280的比值。OD260/OD280应在1.8～2.0之间。D=OD260×n×50/1000…………………………（1）式中：D—DNA的浓度，单位为纳克每微升（μg/μL）；OD260—260nm下的光密度值；n—稀释倍数。8.4PCR反应8.4.1PCR反应体系在冰盘中或4℃条件下进行操作，在25μL反应总体系中，含有10×PCR缓冲液2.0mmol/L，Mg2+2.0mmol/L，dNTPs0.2mmol/L，正向、反向引物各0.3μmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，模板DNA40ng/μL。8.4.2PCR反应程序94℃预变性5min；前5个循环为：94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸1min；后35个循环为：94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min；72℃延伸8min，4℃条件下保存。8.4.3PCR产物的处理PCR结束后，于25μL的反应体系中加入5μL的上样缓冲液，颠倒摇晃混匀后，备用。8.5聚丙烯酰胺凝胶的制备8.5.1玻璃板的清洗用洗涤剂清洗玻璃板（长板和短板），自来水冲洗干净，随后将玻璃板用蒸馏水冲洗2次，再用无屑纸巾沾取无水乙醇擦拭2遍，置于通风橱内垂直晾干待用。DB21/T2589—201648.5.2胶槽装配8.5.2.1玻璃板的固定将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭后置于玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地压盖住，确认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封胶框中并用夹子固定在制胶板上。8.5.2.2封胶配制1%的琼脂糖凝胶，彻底煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免出现气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注，待其室温凝固后进行下一步操作。8.5.3丙烯酰胺胶的配制在50mL8%非变性聚丙烯酰胺储备液中加入100μL10%过硫酸铵和200μL四甲基乙二胺（TEMED)，迅速轻轻混匀。8.5.4灌胶将固定有封好玻璃板的制胶板向后倾斜放置，配好的8%非变性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁缓慢匀速倒入灌胶口中，避免出现气泡，待胶刚要溢出灌胶口时停止灌胶，将梳子轻轻插入灌胶口中，室温凝固1h以上。8.5.5上样和电泳待凝胶完全凝固后，将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下，灌胶口向内用夹子固定在电泳槽上，使用1×TBE缓冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。垂直缓慢将梳子从灌胶口中拔出，并用1×TBE缓冲溶液清洗和整理样品槽。使用200μL移液器从左至右逐个对点样孔进行吹打，直至点样孔内无碎胶、气泡以及其他杂质。取5μL处理后的PCR扩增产物上样，并在胶板的一侧或适当位置的样品槽中加入4μL的DNAMarker（D2000Marker）作为对照，电泳在200V稳压，电流300mA条件下进行，电泳时间约为2.5h～3h。8.5.6卸胶电泳结束，关闭电源，将上槽中1×TBE缓冲液放出，取下固定的夹子，将玻璃板水平放置，起胶铲一侧沿灌胶口边缘缓慢撬起，将紧贴有凝胶的玻璃板放入装有双蒸水的洗胶盘中，使凝胶与玻璃板分离，取出玻璃板，放净双蒸水。8.6银染8.6.1固定将取出的凝胶小心放入装有1L新配制的10%冰乙酸（固定/终止液）的塑料方盒中，水平摇床上80r/min轻摇10min。8.6.2漂洗将胶小心转入双蒸水中漂洗2次，每次2min，放净双蒸水。8.6.3染色在新配好的500mL硝酸银溶液中加入1.6mL37%甲醛溶液，充分混匀后沿一角倒入装