DB13T 2051-2014 幼羔体外胚胎生产技术规程

ICS65.020.30B40DB13河北省地方标准DB13/T2051—2014幼羔体外胚胎生产技术规程2014-07-07发布2014-07-31实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2051—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学、河北省牛羊胚胎工程技术研究中心。本标准主要起草人：田树军、孙树春、金东航、陈晓勇、敦伟涛、贾日东、孟娜娜、刘梦鹤、王春霞、李捷鑫。DB13/T2051—20141幼羔体外胚胎生产技术规程1范围本标准规定了幼羔体外胚胎生产的供体选择、幼羔超数排卵、采集卵丘卵母细胞复合体、体外成熟培养、体外受精、体外胚胎发育培养和胚胎质量检测。本标准适用于利用幼龄羔羊作为供体，进行诱导卵泡发育、活体采集卵丘卵母细胞复合体及体外胚胎生产及科学研究。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1674-2008牛羊胚胎质量检测技术规程3术语及定义3.1供体出生后4～10周龄的雌性羔羊。3.2诱导卵泡发育供体经过外源促性腺激素处理，使其卵巢较在自然状态下有大量卵泡发育的技术。3.3体外胚胎从供体所采集的卵丘卵母细胞复合体经体外成熟、体外受精及体外胚胎发育培养所获得的胚胎。4供体选择要求健康、体况发育良好、系谱资料完整清楚、出生4～10周龄的雌性羔羊。5诱导卵泡发育5.1所使用的生殖激素促卵泡素（FSH）和孕马血清促性腺激素（PMSG）。5.2诱导卵泡发育方法DB13/T2051—20142间隔12h对供体连续4次进行等剂量肌肉注射FSH。FSH的总剂量：FSH（宁波市三生药业有限公司）为280～300IU，FSH（加拿大BIONICHE）为160～200mg。在第一次注射FSH的同时，肌肉注射PMSG500IU。6采集卵丘卵母细胞复合体6.1采集时间于最后一次注射FSH后的12h～16h。6.2采卵前准备6.2.1采卵室及检卵室准备采集前，先将采卵室及检卵室打扫干净，用来苏水等消毒液泼洒地面，关闭门窗，紫外灯照射消毒。采卵室及检卵室适宜温度为20℃～25℃。6.2.2手术器材及药品准备6.2.2.1手术器材6.2.2.1.1手术器械（1套）：手术刀柄1把，20号刀片，直尖手术剪2把，无齿手术镊1把，有齿手术镊1把，止血钳4把（2把弯止血钳、2把直止血钳），持针钳2把（握式持针钳或钳式持针钳），创巾钳6把；止血纱布6块（以上器械用0.1％新洁尔灭溶液在解剖盘内浸泡消毒30min或高压消毒15～20min），缝合针（弯三棱针2个、弯圆针2个），缝合线（10号、7号若干），针盒1个（以上器械用70％酒精在针盒内浸泡30min）；剪毛剪1把，剃须刀1片，大止血钳1把或人用剃须刀具1个（剃毛用）、保定架2个、水浴锅1个、500mL的喷壶3个，15mL的试管架1个，15mL离心管若干、一次性创巾若干，一次性注射器若干（20mL、10mL、5mL、2mL、1mL），18G注射针头若干。6.2.2.2药品含0.9%NaCl的生理盐水，含有0.96万IU青霉素/mL和0.2万IU/mL链霉素的生理盐水，速眠新及苏醒灵，注射用青霉素和链霉素，75％酒精棉球，5％碘酊棉球，碘甘油，5％新洁尔灭溶液，以及采卵液（每只供体准备100mL）。采卵液配方：9.5g/LTCM199+5mmol/LNaHCO3+10mmol/LHEPES+10mmol/LHEPES-Na+0.665g/L肝素钠+20ml/LFBS+0.065g/L青霉素+0.05g/L链霉素。6.2.3手术人员准备手术人员（术者、助手）戴好手术帽和口罩，洗净手及手臂，穿戴好手术衣，手、手臂在盛有0.1％新洁尔灭溶液的泡手桶中浸泡5min，除去手上多余药液，稍后自然干燥，再戴上干燥的无菌手套。6.3保定与麻醉供体肌肉注射速眠新进行全身麻醉，剂量：杜泊绵羊、无角道塞特、夏洛来、特克塞尔等肉用绵羊为0.015mL～0.022mL/kg体重；波尔山羊等肉用山羊为0.020mL～0.030mL/kg体重；奶山羊、绒山羊为0.023mL～0.033mL/kg体重；小尾寒羊为0.017mL～0.023mL/kg体重。供体麻醉后在手术架上仰卧保定。6.4术部除毛DB13/T2051—20143手术部位（简称“术部”）是在脐后部至乳房基部腹白线处或腹白线旁。先用剪毛剪将术部羊毛剪短，再用温肥皂水浸湿，然后用剃须刀将毛剃净，术部剃毛范围为15cm2～20cm2，用清水洗净擦干。6.5术部消毒术部用5%碘酊棉球涂擦，待其干燥后，用75%酒精棉球脱碘。然后用有孔创巾覆盖于术部区域，用创巾钳固定。6.6采集卵丘卵母细胞复合体外科手术打开腹腔，引出卵巢，用带有18G注射针头且吸有约5mL采卵液的10mL注射器抽吸卵巢上的卵泡，当注射器中的抽卵液颜色变浅或略显浑浊时，立即将含有卵丘卵母细胞复合体的抽卵液注入15mL离心管，并放入水浴锅中保存。一侧卵巢卵丘卵母细胞复合体采集完后送入检卵室，再采集另一侧。完毕后，两侧卵巢表面均涂抹碘甘油，送回腹腔，缝合切口，用碘酊棉球消毒创口，并做结系绷带。肌注苏醒灵，剂量为速眠新用量的1～2倍。肌注青霉素160万IU和链霉素100万IU。7体外成熟培养7.1成熟液预平衡在3.5cm（Nunc）培养皿上标记组别、日期等，做100μL的培养滴，覆盖矿物油。另取一只1.5mL离心管，吸取1mL的成熟液放入离心管中。将平皿和离心管（开盖）放入38.5℃、饱和湿度的5%CO2培养箱中，预平衡2～4h。体外成熟培养液配方：84.9%TCM199（v/v）+10%FBS(v/v)+10μg/mLFSH+10μg/mLLH+1μg/mLE2+1mmol/LL-谷氨酰胺+20ng/mLEGF+200μmol/L丙酮酸钠+100μmol/L半胱氨酸。7.2回收卵丘卵母细胞复合体提前打开恒温台调至38.5℃并用75%酒精消毒，分别取3cm、9cm塑料平皿（国产）各4个、5个，将9cm平皿底部划上宽度间隔约为0.7cm的线条。将含有卵丘卵母细胞复合体的采卵液（15mL离心管内）倒入平皿中，然后在显微镜下捡出卵丘卵母细胞复合体，并移入盛有采卵液的3cm平皿中。形态正常、胞质均匀和颗粒细胞不低于3层的卵丘卵母细胞复合体为可用卵丘卵母细胞复合体。7.3卵细胞体外成熟取经过预平衡的成熟液在培养皿中做液滴4～5个，每个液滴的体积为100μL，依次洗涤卵丘卵母细胞复合体，然后将卵丘卵母细胞复合体入孵到覆盖石蜡油的成熟液微滴中，每滴15枚。放于38.5℃、饱和湿度的5%CO2培养箱中，成熟培养24h。8体外受精8.1受精液预平衡DB13/T2051—20144在3.5cm（Nunc）培养皿上标记组别、日期等，做30μL的受精滴，覆盖石蜡油。另取一只1.5mL离心管，吸取1mL的受精液放入离心管中，做好标记，用于洗涤精子，必要时调整精子密度。取1个4mL离心管，装2mL的SOF液，用于精子上浮。取1个200μL的离心管装100μL的0.1%透明质酸酶，将平皿和离心管（受精液开盖，SOF液盖盖）放入38.5℃，饱和湿度的5%CO2培养箱中，预平衡2h～4h。体外受精液配方：SOF液+20%发情羊血清（v/v）+10μg/mL肝素钠。其中SOF液配方：10%StockA（v/v）+5.262mmol/LNaHCO3+200μmol/L丙酮酸钠+1.782mmol/LCaCl2·2H2O+8%StockE(v/v)+2%发情羊血清（v/v）8.2精液处理8.2.1冷冻精液的处理37℃水浴解冻，用200μL移液枪吸取200μL精液并缓慢注入SOF液底部（4mL离心管），倾斜30度角，开口放入培养箱中上浮30min～40min。将上浮完毕的精液，取上清放入1.5mL离心管中，1000rpm，离心8min。弃上清，用受精液调整精子密度为1.0×106为宜。8.2.2新鲜精液的处理新鲜精液用200uL移液枪吸取直接进行精子上浮。上浮操作方法同冷冻精液。8.3脱除卵丘颗粒细胞将体外成熟的卵丘卵母细胞复合体放入预热至38.5℃的0.1%透明质酸酶液滴中，用口吸管轻轻吹打脱除卵丘颗粒细胞至2～3层为宜。8.4体外受精将脱除卵丘颗粒细胞的卵丘卵母细胞复合体在受精液中洗3～4遍后，放入受精液微滴中，每滴15枚卵细胞，加入20μL经过处理的精液。体外受精的适宜精子密度为1.0×106，于38.5℃、5%CO2及饱和湿度条件下精卵共孵育24h。9体外胚胎发育培养9.1胚胎发育液预平衡在3.5cm（Nunc）培养皿上标记组别、日期等，做50μL的发育培养I液微滴，覆盖石蜡油（3mL）。另取一只1.5mL离心管，吸取1mL的发育培养I液放入离心管中，做好标记。将平皿和离心管（开盖）放入38.5℃、饱和湿度的5%CO2培养箱中，预平衡2h～4h。发育液配方如下：发育培养Ⅰ液：SOF液+1%EAA+1%NEAA+10ng/mLEGF+1mmol/LL-谷氨酰胺+8mg/mLBSA。发育培养II液：I液+10%FBS（v/v）+1%EAA发育培养III液：I液+10%FBS（v/v）+1%EAA+1%StockF9.2脱除精子及卵丘颗粒细胞DB13/T2051—20145先将1.5mL离心管中的发育培养I液做滴，取出受精24h的受精卵，在发育液滴里用口吸管反复吹打，去除周边的死精子和卵丘颗粒细胞，清洗3～4遍，然后放入发育培养液微滴中，置于38.5℃、饱和湿度的混合气(5%CO2，5%O2，90%N2)培养箱中培养。9.3更换发育液于受精72h后半量换发育培养II液，受精120h半量换发育培养III液培养。发育培养皿装入一密封塑料袋中，袋内置入湿棉球并充入混合气(5%CO2，5%O2，90%N2)，放入38.5℃、饱和湿度的5%CO2培养箱中培养。之后，于受精第5d统计桑椹胚率，第7d～8d统计囊胚率。10胚胎质量检测按照NY/T1674-2008规定，评定胚胎发育阶段及胚胎质量等级。DB13/T2051—20146AA附录A（资料性附录）各种浓储液配方A.1StockA10×成分用量NaCl6.29gKCl0.534gKH2PO40.162gMgSO4-7H2O0.182g链霉素0.05g青霉素0.065g乳酸钠0.6mL加水定容至100mL，4℃保存。A.2StockB10×成分用量NaHCO30.221g水10mLA.3StockC100×成分用量Napyruvate0.044g水10mLA.4StockD100×成分用量CaCl2-2H2O0.262g水10mLA.5StockE100×成分用量Hepes0.32554gHEPES-Na0.35556g水10mLDB13/T2051—20147A.6StockF100×成分用量Glucose0.27g水10mLA.7肝素钠100×成分用量肝素钠0.01g水10mLA.8E21000×成分用量E20.01g100%酒精10mLDB13/T2051—20148BB附录B（资料性附录）各种培养液及操作液配方B.1成熟液配方成分用量M1998.65mLFBS1.0mLFSH100μLLH100μL丙酮酸钠50μLL-谷氨酰胺50μLEGF20μL半胱胺酸100μLE210μL混匀后，用一次性滤器（0.20μm）过滤，4℃保存。B.2精子上浮液配方成分用量水7.8mLStockA1.0mLStockB0.2mLStockC0.1mLStockD0.1mLStockE0.8mL将其混匀，弃去0.2mL血清0.2mL过滤（0.20μm滤器），4℃保存。DB13/T2051—20149B.3受精液配方成分用量纯水7.8mLStockA1.0mLStockB1.0mLStockC0.1mLStockD0.1mL混匀，弃2.1mL血清(20%V/V)2mL肝素钠(10ug/