DB21∕T 2549-2015 仔猪乳糖酶基因检测技术规程

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2549—2015仔猪乳糖酶基因检测技术规程Methodofdetectinglactasegeneinpiglets2015—12—15发布2016—02—15实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2549—20151前言本标准按照GB/T1.1-2009标准给出的规则制定。附录A、附录B和附录C均为规范性附录。本标准由辽宁医学院提出。本标准由锦州市质量技术监督局归口。本标准起草单位：辽宁医学院。本标准主要起草人：田玉民、苏玉虹、朱弘焱、陶晓丽、王希。DB21/T2549—20152仔猪乳糖酶基因检测技术规程1范围本标准规定了仔猪乳糖酶基因启动子和增强子多态性的检测条件、检测步骤和结果判定的技术要求。本标准适用于仔猪乳糖酶基因检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求GB/T27476.1-2014检测实验室安全第1部分：总则3术语和定义3.1乳糖酶基因Lactasegene,LCT乳糖酶（LCT）又称β-半乳糖苷酶，在特定条件下将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，进而被消化道吸收。仔猪的乳糖酶基因位于染色体15q13，预测CDS全长为5793bp，在基因序列数据库(GenBank)中的登录号为XM_003359430。4防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2第七章规定执行。5安全防护实验室安全防护按GB/T27476.1第五章规定执行。6检测条件6.1实验室条件按GB/T19495.2中的规定执行。6.2扩增仔猪乳糖酶基因片段的PCR引物DB21/T2549—20153扩增启动子SNPG-308C和A-301G片段的PCR引物：——上游引物F：5'-AAAAAGTTTGGTAAGGACCT-3'；——下游引物R：5'-GGAACTGTTAGGAGGTATGTG-3'扩增增强子SNPG-797A片段的PCR引物：——上游引物F：5'-TAAACAAAGCCAAGGACATT-3'；——下游引物R：5'-CTGGGGTGTATGTGCTTGTGG-3'6.3主要试剂用水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。裂解液、10%SDS、饱和酚、TE缓冲液、2×PfuPCRMasterMix、蛋白酶K、凝胶回收纯化试剂盒、测序试剂盒等。具体配制方法参见附录A。6.4主要仪器微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、pH计、精度0.1g分析天平、涡旋混合仪、电泳仪、全自动DNA测序仪等。7检测步骤7.1样品的采集用猪耳号钳子夹取仔猪耳部边缘组织0.5cm3，立即置于装有75%乙醇的1.5mLEp白色塑料管中，-20℃保存备用。7.2仔猪基因组DNA提取采用常规的酚-三氯甲烷法提取，并测定DNA溶液浓度。具体方法参见附录B。7.3乳糖酶基因5'UTR区启动子SNPG-308C和A-301G的检测15μL反应体系：DNA模板50ng、10μmol/L上下游引物各1μL、2×PfuPCRMasterMix7.5μL、加灭菌双蒸水至15μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长度为318bp。PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0凝胶回收纯化试剂盒对PCR产物纯化。用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0测序试剂盒对PCR产物测序反应。然后在ABI3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳和序列测定，获得序列色谱图ABI文件。通过SequencingAnalysis和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判读。7.4乳糖酶基因5'UTR区增强子SNPG-797A的检测DB21/T2549—2015415μL反应体系：DNA模板50ng、10μmol/L上下游引物各1μL、2×PfuPCRMasterMix7.5μL、加灭菌双蒸水至15μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长度为147bp。PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30S，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0凝胶回收纯化试剂盒对PCR产物纯化。用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0测序试剂盒对PCR产物测序反应。然后在ABI3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳和序列测定，获得序列色谱图ABI文件。通过SequencingAnalysis和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判读。8结果判定8.1启动子SNPG-308C和A-301G基因型判定启动子G-308C和A-301G呈完全连锁，因此仅有2个等位基因：GA和CG。如果测序结果仅有等位基因GA，基因型为纯合子GAGA；如果测序结果仅有等位基因CG，基因型为纯合子CGCG；如果测序结果有两种等位基因：GA和CG，基因型为杂合子GACG。测序结果参考附录C中图C.1判定。8.2增强子SNPG-797A基因型判定增强子SNPG-797A仅有2个等位基因：G和A。如果测序结果仅有等位基因G，基因型为纯合子GG；如果测序结果仅有等位基因A，基因型为纯合子AA；如果测序结果有两种等位基因：G和A，基因型为杂合子GA。参考附录C中图C.2判定。9废弃物处理实验过程中所产生的废弃物按GBT27476.1中的规定执行。DB21/T2549—20155附录A（规范性附录）主要试剂及配制方法表A.1主要试剂及配制方法试剂配制方法裂解液（pH8.0）50mmol/LTris-HCl,50mmol/LNa2EDTA，SDS30g/L，使用HCl或NaOH调节pH蛋白酶K溶液20mg/mL蛋白酶K，无菌水溶解，-20℃保存，避免反复冻融10%SDS（pH7.2）100g/LSDS，37℃去离子水加热溶解，使用HCl调节pH，室温保存饱和酚：三氯甲烷：异戊醇25:24:1(体积比)三氯甲烷：异戊醇24:1(体积比)TE缓冲液（pH8.0）10mmol/LTris-HCl,1mmol/LNa2EDTA，使用HCl或NaOH调节pH2×PfuPCRMasterMix0.05U/μLPfuDNAPolymerase，0.4mmol/LdNTPs，4mmol/LMgCl2DB21/T2549—20156附录B（规范性附录）仔猪基因组DNA提取方法B.1组织消化将需要提取DNA的耳组织剪碎（无肉眼可见颗粒状组织）置于1.5mLEP管中，加入400μL裂解液、10%SDS200μL，蛋白酶K10μL，混匀置于56℃金属浴过夜。B.2DNA提取DNA提取方法：a)取出金属浴内的样品管，凉至室温，4℃，12000r/min，离心10min；b)取上清液至新的EP管中，加入等体积的饱和酚，颠倒混匀10min；c)4℃，12000r/min，离心10min；d)取上清液至新的EP管中，加入等体积的饱和酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀10min；e)4℃，12000r/min，离心10min；f)取上清液至新的EP管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀10min；g)4℃，12000r/min，离心10min；h)取上清液至新的EP管中，加入2.5倍体积的冰无水乙醇，轻柔混匀，置-20℃冰箱中放置30min。i)4℃，12000r/min，离心20min；j)弃上清液，加入1mL75%酒精漂洗，4℃，12000r/min，离心10min（此步骤重复2次）；k)4℃，12000r/min，离心20min；l)弃上清液，使管内酒精挥发干净；根据沉淀情况加入适量（建议40μL）TE缓冲液溶解，-20℃保存。B.3DNA含量的测定样品中提取的DNA含量测定用核酸蛋白测定仪进行测定。取适量DNA溶液加TE缓冲液进行稀释，分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280，DNA的浓度按式（1）计算：c=A×N×50/1000(1)式中：c——DNA浓度，μg/μL；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。当A260/A280比值处于在1.6～1.9之间时，即可用于PCR扩增。DB21/T2549—20157附录C（规范性附录）仔猪LCT基因启动子和增强子测序结果图图C.1仔猪乳糖酶基因启动子SNPG-308C和A-301G的序列峰图图注：A为等位基因GA；B为等位基因CG图C.2仔猪乳糖酶基因增强子SNPG-797A的序列比对峰图图注：A为等位基因G；B为等位基因A_____________________________ABAB