DB21∕T 2268-2014 球孢白僵菌质量控制及防治玉米螟技术规程

ICS65.020B16DB21辽宁省地方标准DB21/T2268—2015球孢白僵菌质量控制及防治玉米螟技术规程ThetechnicalrulesofqualitycontrolandfieldapplicationofBeauveriabassiana2014–11-19发布2015-01-19实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2268—2015I目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13定义与术语.........................................................................14工厂化生产步骤与方法...............................................................25包装、贮存、运输...................................................................46产品质量检测.......................................................................57防治玉米螟田间使用技术.............................................................6DB21/T2268—2015II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。本标准由辽宁省植物保护站负责起草。本标准主要起草人：范垂鹏、朴春树、马辉、张万民、洪晓燕、屈丽莉、张丹、杜冰、梁英。DB21/T2268—20151球孢白僵菌质量控制及防治玉米螟技术规程1范围本标准规定了球孢白僵菌质量控制及防治玉米螟技术的定义与术语、工厂化生产步骤与方法，包装、贮存、运输，产品质量检测和防治玉米螟田间使用技术。本标准适用于球孢白僵菌工厂化生产和田间玉米螟防治。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3796农药包装通则GB/T16150农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法GB/T1605商品农药采样方法GB/T25864球孢白僵菌粉剂3定义与术语下列定义和术语适用于本标准3.1球孢白僵菌球孢白僵菌Beauveriabassiana(Bals)Vuill是一种虫生真菌，属于真菌界，半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomyeetes)丛梗孢目(Moniliales)丛梗孢科(Moniliaeeae)白僵菌属(Beauveria)。3.2固体双相发酵生产工艺采用液体发酵生产菌丝、节孢、芽孢，再接种到固体培养基上进行固体发酵产生分生孢子的生产工艺。3.3斜面菌种为斜面试管生产的菌种（分生孢子）。3.4液体菌种DB21/T2268—20152将斜面种子接到液体培养基里发酵成的菌丝、节孢。3.5旋风分离法原菌粉经抽风机压入扬孢机内,随扬孢机进行正、反向运转扬孢，大部分孢子随气流经分离器中间的管道，流入分流器而沉降在集孢器形成孢子粉的生产过程。3.6原菌粉固体发酵后未经旋风分离集孢器或粉碎机处理的菌粉。3.7高孢粉孢子含量为1000×l08个/g以上的白僵菌菌粉。4工厂化生产步骤与方法4.1僵虫分离采集健康的玉米螟幼虫，分装于试管，在压力1.1kg/cm2灭菌30min，冷却后无菌操作条件下进行接种，如此重复转管2次~3次可获得较好的复状，经紫外线灯或日光照射，高温处理，从中选取生长强壮的典型菌落移接，作为新的生产菌种。4.2一级斜面菌种的制备4.2.1斜面培养基配方马铃薯20%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、琼脂2%。4.2.2无菌考察将灭过菌的斜面培养基置于28℃恒温箱中培养2d，如无杂菌长出，方可供接菌种应用。4.2.3斜面接种须在超净工作台上进行，先开超净工作台上的紫外光灯30min，照射斜面试管及接种用具，然后采用无污染的优良菌株接种。4.2.4斜面菌种培养在25℃±1℃的室内或培养箱中培养（逐日检查，如有杂菌者即剔除）；培养7d，可作菌种用。4.3二级液体菌种制备(种子罐)4.3.1培养液配方米粉7%、花生枯2%、麦麸2%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%。DB21/T2268—201534.3.2空罐消毒、空气过滤器消毒压力1.5kg/cm2，保压30min，然后关闭各进出气阀门，吹进无菌空气，稍为降温，便可投料。4.3.3投料把按配方配好培养液打开手孔倒入种子罐，并加0.2%消泡剂(花生油或其他食用油)，然后上紧手孔。4.3.4实罐消毒压力1.1kg/cm2，保压lh，待降温到27℃时接种。4.3.5接种接种量菌料比为1:10，将合格菌种在无菌操作条件下移入接种瓶中；接种时先解开种子罐接种阀门纱布，同时迅速点燃酒精火圈，在火焰上方解开接种瓶胶管末端螺旋接头的纱布，迅速扭上接种阀，然后调节好接种瓶和罐内的压力，利用压力将菌种液接入罐内（整个接种过程罐内保持正压）。接种毕，旋下接种接头，调节好进出气口，开动搅拌开关，开始培养。4.3.6培养罐压0.5kg/cm2，通气量为l:l，罐温25℃±1℃，培养时间为30h。检验合格可作为二级菌种。4.4三级扩大液菌种制备(发酵罐)4.4.1液种配方米粉7%、花生枯2%、麦麸2%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%。4.4.2罐体消毒压力1.5kg/cm2，保压30min。4.4.3实罐消毒和管道消毒在发酵罐进行实罐消毒的同时，进行种子罐与发酵罐接种管道的消毒，消毒时微开管道上各有关排气阀门，务必使整条管道畅通，不成死角，调节进气阀至管内压力1.5kg/cm2，保压30min，然后自前至后依次关闭各进气阀，冷却待用。4.4.4移种通过两罐压差，将合格的二级液种按1:10的比例压到发酵罐，压种毕迅速关闭两罐出料阀，然后调节好罐压力和进、排气阀，开动搅拌、进行培养。4.4.5培养搅拌速度200rpm，罐温5℃±1℃，罐内压力0.5kg/cm2，通气量l:0.7。培养30h，供固体接种用。培养过程中每隔4h抽样检查1次。4.4.6液种罐发酵管理在接种后12h开始，每4h取样进行镜检，测定菌丝形态，芽生孢子数量、有否杂菌污染等。如有杂菌污染，菌种不能使用。DB21/T2268—201544.5四级固体开放培养4.5.1配方稻壳与麦麸重量比为6:4。4.5.2固体培养基的灭菌压灭菌压力为1.1kg/cm2，保压60min，冷却后待用；常压灭菌，利用蒸气消毒柜消毒，100℃保温2h，冷却待用。4.5.3培养盘灭菌洗净培养盘，放于常压灭菌柜灭菌30min，冷却待用。4.5.4拌种机灭菌每立方米空间用3ml~5ml40%福尔马林溶液和2g~3g高锰酸钾进行熏蒸灭菌。4.5.5培养室、培养盘支架灭菌培养支架用4脚式长方体钢架结构，上、下间距20cm，支架与培养室一起进行熏蒸灭菌。4.5.6液、固接种采用拌种机进行接种，液固接种比例为1:1.5~1.7；固体培养基厚度为3cm~4cm，一般在温度比较低、空气干燥时可达4cm，温度高时3cm，培养盘表面盖通风透气簸箕为好。4.5.7固体培养室的管理培养室温度控制在18℃~24℃；培养室相对湿度在24h内控制在95%以上；在培养基表面如发现杂菌污染，应马上进行处理；揭盖、培养4d后，待培养基表面菌丝全面复盖变白，可揭去培养盘表面的簸箕，两盘对合，中间留些间隙，培养室的温度可提高到25℃±1℃培养室的相对湿度缓慢降低，培养至第7d，培养基里外都长满了乳黄色的孢子，这时可进行干燥处理。4.6白僵菌粉干燥处理将培养好的原菌粉自然晾干4d，然后进行控温干燥，35℃干燥40h或48℃干燥24h，至原菌粉含水率为12%以下。4.7高孢粉的提取用旋风分离法搅拌扬孢6min~8min，打开残渣出口，将残渣排出后可继续进行抽提工作。要求孢子抽提率达10%以上，孢子回收率达85%以上，含孢量达1000×108个/g以上，孢子粉含水率达12%以下，活孢率95%以上。4.8常规菌粉的加工测定原菌粉的含孢量，然后根据所需的含孢量，按比例加入填充料，配成为100×108个/g、50×108个/g可湿性粉剂。5包装、贮存、运输DB21/T2268—201555.1包装按需求采用5kg/袋或10kg/袋，用塑料袋包装后，外层再套编织袋；包装袋内应放菌粉使用说明书，包装外挂放标签（标签内容应包括生产厂家、厂址、产品名称、含孢量、活孢率、含水率、生产日期、防治对象、使用方法和有效期等）。5.2贮存、运输及注意事项贮存应选择干燥通风避光场所，常温贮存不超过180d，超过180d使用的应放于4℃处冷藏。运输中应防潮、防晒、防高温（低于35℃），严禁与杀菌剂混用。6产品质量检测6.1产品质量要求6.1.1含孢量1000×108个/g、100×108个/g、50×108个/g。6.1.2活孢率95%以上（1000×108个/g）、90%以上（50×108个/g、100×108个/g）。6.1.3含水率12%以下。6.1.4粉粒细度1000×108个/g孢子粉过160筛目；50×108个/g和100×108个/g孢子粉过36筛目。6.1.5孢子毒力将孢子粉喷在玉米螟5龄幼虫上后，温度控制在20℃~28℃，相对湿度控制在90%以上，5d~7d，玉米螟出现死亡高峰，7d~10d玉米螟死亡率达95%以上。6.2产品质量检验6.2.1样品抽取每批产品抽取一个样品，相当于产品总数的千分之一作送检样品，将样品搅拌均匀后摊平按对角线平均法或随机取样点状抽取各项检验用小样品。6.2.2含孢量测定用精度为万分之一的电子天平称取受检菌粉1g，置于组织捣碎机的玻璃缸内，加蒸馏水100ml，再加入吐温-804mL，捣碎2min，再加入300mL再捣碎1min，制成孢子悬浮液，用纽鲍尔（Neubauer）血球计数板（16×25或25×16的计数板）计数，加盖配套专用的盖玻片，用吸管吸取菌液，沿盖玻片边缘滴入，使菌液充满盖玻片与载玻片之间的间隙（勿出现气泡，侧沟内不能溢出菌液），静止片刻，用600倍显微镜镜检计数。每个样品设3个重复，取其平均值。如果用血球计算板计数格为25个中格，每个中格为16个小格，则计算双线范围内4个角上的4个中格和中间一个中格共80个小格内的总孢子数，计算公式为：DB21/T2268—20156801045/1068稀释倍数个中格孢子总数）个含孢量（×××=×g如果用血球计算板计数格为16个中格，每个中格为25个小格，则计算双线范围内4个角上的4个中格的100个小格内的总孢子数，计算公式为：1001044/1068稀释倍数个中格孢子总数）个含孢量（×××=×g6.2.3活孢率测定将100mL营养液（蛋白胨0.5%、蔗糖2%或2%麦芽浸粉）加入250mL三角瓶，高压灭菌冷却后，放待测菌粉0.1g，置于全温振荡培养箱在25℃条件下培养24h。取样制片镜检，镜检用血球计数板，取5个中格，数出每个中格发芽（孢子膨胀比原孢子大1倍或萌芽长度大于孢子半径）与未发芽孢子数，每个样品3个重复，取其平均值，允许误差10%。按下列公式计算活孢率。未发芽数）孢子总数（发芽数发芽孢子数）活孢率（+=%×1006.2.4含水量测定先将玻皿在120℃干燥箱内烘干，15min后取出用万分之一的电子天平称重；再称5