DB21∕T 2472-2015 H1N1亚型不同谱系猪流感病毒核酸RT-PCR鉴别诊断技术规范

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2472—2015H1N1亚型不同谱系猪流感病毒核酸RT-PCR鉴别诊断技术规范DiagnosticTechniquesproceduresofRT-PCRassayfordifferentingsubtypesofH1N1SwineInfluenzaVirusnucleicacid2015-04-30发布2015-06-30实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2472—2015I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：兰德松、顾贵波、赵凤菊、魏澍、李晓楠、孙世宇、杨作丰、李清竹、李红魁、申贯男、王海丰DB21/T2472—2015II引言猪流感（SI）是由A型猪流感病毒（SIV）感染猪引起的一种严重的呼吸道及免疫抑制传染病，已在世界大部分国家广泛存在并造成严重经济损失，是目前危害养猪业的重大疾病之一。同时猪被认为是流感病毒重组的“混合器”，SIV对流感病毒的流行、遗传衍化、跨物种传播以及在公共卫生学上都具有重要意义。从国内和我省近年来猪群中的检测结果来看，猪群主要以H1N1亚型SIV流行为主并危害严重。H1N1亚型SIV主要以经典型、类禽型和甲型H1N1三个谱系感染最为普遍，危害最大。针对H1N1三个不同谱系的SIV，国内尚无RT-PCR检测方法方面的技术规范，应用本技术规范可在实验室对经典型、类禽型和甲型H1N1三个不同谱系的SIV做出快速、准确诊断，进而有针对性地采取综合防控措施。因此，本规范对于猪流感的检测和控制具有重要的意义，同时也为人、猪、禽流感防控提供预警信息奠定重要基础。DB21/T2472—20151H1N1亚型不同谱系猪流感病毒核酸RT-PCR鉴别诊断技术规范1范围本标准规定了H1N1亚型不同谱系（甲型H1N1、经典H1N1及类禽型H1N1）猪流感病毒（Swineinfluenzavirus，SIV）RT-PCR检测方法。本标准适用于甲型H1N1、经典H1N1及类禽型H1N1亚型猪流感的鉴别诊断和监测，适用于猪鼻咽拭子、脏器、鸡胚尿囊液及细胞培养物中H1N1亚型SIV核酸的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。SIV：猪流感病毒（Swineinfluenzavirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）bp:碱基对（Basepair）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）MLV:莫洛尼鼠白血病病毒（Murineleukemiavirus）DTT：二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol）PBS:磷酸缓冲液（Phosphatebuffersoulution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）4原理SIV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5仪器和器材DB21/T2472—20152高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）。冰箱（2～8℃，-20℃和-70℃）。PCR扩增仪。电泳仪。凝胶成像系统。微波炉。微量移液器。6试剂和材料6.1Trizol：RNA提取抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃预冷。6.3异丙醇：4℃预冷。6.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。6.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h；（121士2）℃，高压灭菌15min。6.6RNA酶抑制剂（40U/μL）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP(2.5mmol/L)。6.9用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列如下：经典型上游引物F:GGACATGTTACCCAGGAGA经典型下游引物R:ACTGGTAGGTGGATGGTGAA类禽型上游引物F:TGGAGCATGCTACCCCGGAGA类禽型下游引物R:CCATACATCCAAAAACCCATC甲型上游引物F:TATTCCCCAAGACAAGTTCA甲型下游引物R:ATCGTGGACTGGTGTATCTG6.10反转录酶：M-MLV反转录酶（5U/μL）。6.11DTT(0.1mmol/L)。6.12反转录引物Uni12：AGCAAAAGCAGG（20μmol/L）。6.13阴性对照：DEPC水。6.14阳性对照：不同谱系SIV阳性质粒。6.15PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.16TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液。6.17溴化乙锭。6.18DL2000DNAMarker。注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放和运送7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，防止样本交叉污染。DB21/T2472—201537.1.2采样工具病毒采集管；经121（士2）℃高压灭菌15min的15mL离心管和1.5mL离心管；经160℃干热灭菌2h的剪刀、镊子。7.1.3猪鼻腔、咽喉拭子的采集与前处理用病毒采集管采取临床疑似活体猪的鼻腔、咽喉拭子，编号备用，待检。7.1.4猪脏器的采集与前处理7.1.5称取1克病死猪的肺脏，进行研磨，然后加入1mL灭菌PBS，混匀，3000r/min离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6鸡胚尿囊液将无菌收集盲传三代的鸡胚尿囊液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.7细胞培养液细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.8存放与运送采集或处理的样品在2~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置温度低于-70℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2RT-PCR检测7.2.1RNA提取7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性管数+阴性管数，对每个离心管进行编号。7.2.1.2每管加人750μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250μL，颠倒10次混匀，室温静置5min；再加入250μL氯仿，混匀器上振荡混匀15s(也可以用手反复颠倒混匀)。4℃12000g离心15min。7.2.1.3取与7.2.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)。取7.2.1.2中离心后的上清液约500μL转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置15min。7.2.1.44℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%DEPC乙醇，洗涤。7.2.1.54℃12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗涤2次。7.2.1.64000g离心10s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3~10min。7.2.1.7加入20μL经DEPC处理的水，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增；若需长期保存应放置-70℃冰箱。7.2.2反转录7.2.2.1反转录体系建立25μL的反应体系，按下列组分加入离心管中：DB21/T2472—20154DEPC水8.5µLdNTP（2.5mmol/L）2µLUni12引物(20µmol/L)1µLDTT(0.1mmol/L)2.5µL5×ReverseTranscriptaseXLBuffer(5倍缓冲液)5µLM-MLV反转录酶0.5µLRNA酶抑制剂0.5µL实验样品RNA5µL7.2.2.2反转录条件混匀后在37℃水浴锅中反应1h；在70℃水浴锅中反应15min；反转录产物直接用于PCR或-20℃保存备用。7.2.3PCR7.2.3.1PCR反应体系建立25μL的反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：PremixEXTaq12.5μL反转录产物（cDNA）1μL上游特异性PCR引物(20µmol/L)0.5μL下游特异性PCR引物(20µmol/L)0.5μL灭菌蒸馏水10.5μL7.2.3.2PCR反应反应条件94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸7min。7.2.3.3电泳取PCR扩增产物6μL点样于1%琼脂糖凝胶（见附录A）板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DNA2000Marker（分子质量标准物质）6μL，缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳20min，将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。8试验成立的条件当甲型H1N1SIV阳性对照出现在476bp扩增条带、阴性对照未出现目的条带；经典H1N1SIV阳性对照出现在293bp扩增条带、阴性对照未出现目的条带；类禽型H1N1SIV阳性对照出现在997bp扩增条带、阴性对照未出现目的条带时，表明试验有效，否则试验无效。9结果判定9.1阳性判定应用甲型H1N、经典H1N1和类禽型H1N1三种谱系H1N1SIV的检测引物，按照各基因检测体系对样品进行检测，被检样品出现476bp扩增条带则判定为甲型H1N1SIV核酸阳性；出现293bp扩增条带则判定为经典H1N1SIV核酸阳性；出现997bp扩增条带则判定为类禽型H1N1SIV核酸阳性。DB21/T2472—201559.2阴性判定如果在所用不同谱系检测引物预期扩增片段的位置未出现目的条带，则判定为相应谱系H1N1SIV核酸阴性。DB21/T2472—20156AA附录A（规范性附录）试剂配制A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H20)71.64g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H20)31.21g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氢二钠溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL，称取氯化钠38g，用无离子水溶解稀释至5000mL，4℃保存。A.2电泳缓冲液(50倍)A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二铵四乙酸二钠(分析纯)18.61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水加至100mLA.2.2TAE(三羟甲基氨基甲烷-乙酸)电泳缓冲液(50倍)羟基甲基氨基甲烷(Tris)（分析纯)242g冰乙酸57.1mL0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)100mL灭菌双蒸水加至1000mL用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.31%琼脂糖凝胶琼脂糖(电泳级)1gTAE电泳缓冲液(50倍)2mL灭菌双蒸水98mL微波炉中完全融化，加溴化乙锭(EB)溶液10μL(终浓度为10mg/mL)。