DB32∕T 1775-2011 I型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR 方法

ICS65.020.30B41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1775—2011Ｉ型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR方法MethodofRT-PCRdetectingDuckVirusHepatitisI2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1775—2011I前言为规范Ｉ型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术，提高鸭肝炎病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准结构和编写》编制。本标准的附录A为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：魏雪涛、李银、刘宇卓、张敬峰。DB32/T1775—20111Ｉ型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR方法1范围本标准规范了Ｉ型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于检测鸭肝脏和病毒尿囊液中I型鸭肝炎病毒核酸。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样3方法原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术却以其快速、敏感和特异等优点在动物疫病检测中得到广泛应用，而且随着PCR技术的不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法表现出更准确、灵敏和特异的特点。本标准选取了DHVIVP1基因的保守，设计了一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性实验、敏感性试验等，对DHVI的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备：PCR仪，离心机，电泳槽，微量移液器，凝胶成像系统4.2主要试剂：TRIZOL，氯仿，异丙醇，无水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水，AMV反转录酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，RNA酶抑制剂，25mmol/LMgCl2，EXTaqDNA聚合酶，10×EXTaqDNA聚合酶buffer，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，琼脂糖。5引物上游引物：5′-ATCTAATGTCCCGATACAAGGTG-3′；下游引物：5′-ACGCTAGTGTTTTGAGTCTAAGGC-3′。6样品采集按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀鸭，无菌采集肝脏组织。7方法步骤DB32/T1775—20112试验用水：按照GB-T6682-2008三级水标准7.1样品处理取病料0.5g～1g置研钵中剪碎并研磨，反复冻融研磨，将研磨好的组织，用生理盐水1︰5稀释，以4℃12000r/min离心10min，取上清200µL备用。阴性对照：没有发病的正常鸭肝脏阳性对照：用中和试验检测DHV阳性肝脏样品（见附录A）7.2DHVRNA的提取取已处理的待检样品，以DHV阳性病毒为阳性对照，以正常肝脏作为阴性对照，无菌水为空白对照，每管依次加入Trizol600µL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃12000r/min，离心15min，取上层水相750µL，加入500µL异丙醇，混匀，﹣20℃放置15min，4℃12000r/min,离心15min，去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000r/min离心5min，去上清，室温干燥RNA样品沉淀20min，加入DEPC水10µL，使充分溶解。7.3RT-PCR反转录反应：5×AMVBuffer4μL、10mmol/LdNTPs2μL、下游引物1μL、RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板10μL，AMV反转录酶0.5μL，H2O（DEPC处理）2μL，总体积为20μL，瞬间离心混匀，65℃反应15min，42℃孵育1h，95℃5min，同时设立阴性、阳性对照，产物于﹣20℃保存备用。PCR的反应：按25µL体系进行，含MgCl2（25mmol/L）1.5µL，灭菌水15µL，反转录产物4µL，10×EXTaqDNA聚合酶buffer2.5µL，2mmol/LdNTP0.5µL，上、下游引物50pmol/µL各0.5µL，EXTaqDNA聚合酶0.5µL。94℃3min，然后进入循环94℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。7.4结果观察将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min，紫外灯下观察结果，并进行拍照。8结果判定在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带是判定结果。检测样品出现与阳性对照相同目的条带大小为365bp的扩增片段是，判定为该样品为I型鸭肝炎核酸阳性；否则判定维阴性。如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。DB32/T1775—20113附录A(规范性附录)阳性样品的制备用中和试验检测DHV阳性肝脏样品，阳性样品按如下方法制备：首先，无菌采集新鲜DHV阳性鸭肝脏，用无菌的剪刀剪碎并称量，然后以质量比1∶5加入DEPC（diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯）水，研磨成悬液，装入用DEPC处理过的离心管中，于﹣20℃反复冻融3次，以12000r/min，冷冻离心20min，取上清接种11日龄鸭胚，0.1mL/枚。置37℃恒温箱继续培养，每天照蛋观察3次。弃去24h前死亡胚，无菌收获24～120h死亡胚液，无菌分装，并进行病毒效价测定，病毒含量（EID50）达到10-3/0.1mL以上，即可作为阳性对照，﹣20℃保存备用。