DB21∕T 2251-2014 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2251—2014猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法MethodofRT-PCRforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirus2014-03-07发布2014-05-07实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2251—2014I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：于学武顾贵波陈瑶赵晓彤赵凤菊刘坤洋关乃鹏王珊珊刁贺军王冰邓文超DB21/T2251—20141猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）RT-PCR检测方法的仪器和器材、试剂和材料、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。本标准适用于猪流行性腹泻的诊断和监测，适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PEDV核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）BP：碱基对（basepair）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）4原理PEDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5仪器和器材本技术规范中需使用的主要仪器和器材有高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）、冰箱（2~8℃，-20℃和-70℃三种）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管、0.2mL离心管、微量移液器和吸头。6试剂和材料DB21/T2251—201426.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃预冷。6.3异丙醇：4℃预冷。6.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。6.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121（士2）℃，高压灭菌15min。6.6RNA酶抑制剂（40U/μL）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP(2.5mmol/L)。6.9用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列如下：上游引物F：5′-TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG-3′下游引物R：5′-CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT-3′6.10反转录酶：AMV反转录酶（5U/μL）。6.11反转录引物：OligodT-AdaptorPrimer（2.5μmol/L）。6.12阴性对照：DEPC水。6.13阳性对照：PEDV细胞培养物。6.14PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.15TAE：三羟甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓冲液。6.16溴化乙锭。6.17DL2000DNAMarker。注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放和运送7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121（士2）℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干烤2h。7.1.3肠内容物的采集与前处理DB21/T2251—20143采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。7.1.4粪便的采集与前处理用药匙采取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。7.1.5细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6存放与运送采集或处理的样品在2~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2RT-PCR检测7.2.1RNA提取在核酸提取室进行。7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。7.2.1.2每管加入750μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250uL，颠倒10次混匀，室温静置5min；再加入250μL氯仿，混匀器上振荡混匀15s（也可以用手反复颠倒混匀）。4℃12000g离心15min。7.2.1.3取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)。取7.1.2中离心后的上清液约500μL转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置15min。7.2.1.44℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%乙醇，颠倒洗涤。7.2.1.54℃12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。7.2.1.64000g离心10s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3~10min。7.2.1.7加入20μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增；于-70℃冰箱长期保存。7.2.2反转录7.2.2.1反转录体系建立10μL的反应体系，按下列组分加入离心管中：MgCl22μL10×RTBuffer1μLRNaseFreedH2O3.75μLDB21/T2251—20144dNTPMixture(各10mM)1μLRNaseInhibitor0.25μLAMVReverseTranscriptase*10.5μLOligodT-AdaptorPrimer0.5μL实验样品RNA1μL7.2.2.2反转录条件42℃1h；95℃5min；5℃5min。7.2.3PCR7.2.3.1PCR反应体系建立50μL的反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：5×PCRBuffer10μL灭菌蒸馏水28.75μLHSTaqDNA聚合酶0.25μL上游特异性PCR引物0.5μL下游特异性PCR引物0.5μL反转录产物10μL7.2.3.2PCR反应条件94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃终延伸10min。7.2.3.3电泳将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1.2%琼脂糖凝胶（见附录A）板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker（分子质量标准物），缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳25min。8结果判定紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对照出现在428bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现428bp扩增条带为PEDV阳性，未出现428bp扩增条带的样品判为阴性。DB21/T2251—20145图注：M—DL2000DNAMarker，N—阴性对照，P—阳性对照，1、2、5、6、7—阴性样品，3、4—阳性样品图1PCR扩增产物电泳检测结果DB21/T2251—20146附录A（规范性附录）A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)71.64g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)31.21g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氢二钠溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL，称取氯化钠38g，用无离子水溶解稀释至5000mL，4℃保存。A.2电泳缓冲液(50倍)A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二铵四乙酸二钠(分析纯)18.61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水加至100mLA.2.2TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50倍)羟基甲基氨基甲烷(Tris)（分析纯)242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)100mL灭菌双蒸水加至1000mL用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.31.2%琼脂糖凝胶琼脂糖(电泳级)1.2gTAE电泳缓冲液(50倍)2mL灭菌双蒸水98mL微波炉中完全融化，加溴化乙锭(EB)溶液10μL。A录C（规范性附_________________________________