DB32∕T 2583-2013 饲料中饲用芽孢杆菌的测定

ICS65.120B22备案号：40469-2014江苏省地方标准DB32DB32/T2583-2013饲料中饲用芽孢杆菌的测定DeterminationofBacillusinfeed2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2583-2013前言本标准编写按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准由江苏省农业科学院畜牧研究所、江苏省动物卫生监督所负责起草。本标准主要起草人为宦海琳、周维仁、闫俊书、白群安。DB32/T2583-20131饲料中饲用芽孢杆菌的测定1范围本标准规定了饲料中饲用芽孢杆菌的测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、预混料、饲料添加剂中饲用芽孢杆菌的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备GB/T4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定（原文中的参考文献）3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1芽孢杆菌bacillus一类能形成芽孢（内生孢子）的杆状细菌的通称。与饲料工业密切相关的芽孢杆菌主要为芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草芽孢杆菌(Bacillussubulis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、迟缓芽孢杆菌（Bacilluslentus）和短芽孢杆菌属(Brevilbacillus)的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)。3.2菌落数aerobicplatecount饲料检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。4原理取一定量检样的稀释液，将其在80℃下加热10min，涂布在NA琼脂内，于36℃条件下培养48h，菌落计数，算出每g（mL）检样中的芽孢杆菌总数。5设备和材料5.1分析天平感量0.1g，0.1mg。5.2振荡器5.3粉碎机DB32/T2583-20132非旋风磨，密闭要好。5.4恒温水浴锅5.5恒温培养箱5.6pH计（精确到±0.1个单位）或精密pH试纸5.7灭菌锥形瓶500mL、250mL。5.8无菌吸管1mL（具0.01刻度）、10mL（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。5.9灭菌试管18mm×180mm、15mm×150mm。5.10灭菌玻璃珠5.11灭菌玻璃或塑料培养皿5.12玻璃涂布棒5.13光学显微镜1000倍。6稀释液、培养基和试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当纯度的水。6.10.85%灭菌生理盐水6.2营养琼脂（NA）培养基参见附录A中的A.1。6.3革兰氏染色液参见附录中的A.2。6.4二乙酰（V-P）测定培养基和试剂参见附录中的A.3。6.5L-阿拉伯糖发酵、D-木糖发酵、D-甘露醇发酵培养基参见附录中的A.4。6.6明胶液化培养基参见附录中的A.5。6.7淀粉水解培养基参见附录中的A.6。6.8丙酸盐利用培养基参见附录中的A.7。6.9柠檬酸盐利用培养基DB32/T2583-20133参见附录中的A.8。6.10硝酸盐还原培养基和试剂参见附录中的A.9。6.117%氯化钠生长培养基参见附录中的的A.10。6.12厌氧生长测定培养基参见附录中的A.11。7检样的制备按照GB/T14699.1进行采样，采样工具如铲子、匙、采样器、试管等，应是无菌的。样品送到微生物检验室应尽快检验。按照GB/T20195进行检样的制备，样品制备后应尽快检验。8操作步骤8.1试样稀释8.1.1以无菌操作称取试样25g（mL），放于含有225mL0.85%灭菌生理盐水的灭菌三角瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠），置振荡器上振荡30min，经充分振摇后，制成1：10的均匀稀释液。8.1.2用无菌吸管或微量移液器吸取1mL的1:10稀释液，沿管壁慢慢注入含有9mL灭菌生理盐水的试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管，制成1:100的稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释液。8.2接种和培养选择2个-3个适宜的稀释度，水浴80℃±1℃维持10min，每个稀释度吸取0.1mL稀释液接种到两个营养琼脂平板上，使用涂布棒进行表面涂布。涂布好的平皿盖好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置36℃±1℃培养箱中培养48h±2h。8.3芽孢杆菌计数用肉眼观察，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。8.3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。8.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用；而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。9结果与报告9.1芽孢杆菌总数的计算方法9.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。9.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算。DB32/T2583-20134dnnCN)1.0(21………………………………………………………………………………（1）式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1:100000（第一稀释度）1:1000000（第二稀释度）菌落数（CFU）232，24433，3524727272000022.054410)]21.0(2[3533244232)1.0(521dnnCN上述数据按9.2.2数字修约后，表示为25000000或2.5×107。9.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。9.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。9.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。9.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。9.2芽孢杆菌总数的报告9.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。9.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。9.2.3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。10芽孢杆菌的鉴定（可选择）10.1概述目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准鉴定试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行菌种鉴定10.2纯培养自平板上挑取5个菌落，分别划线接种于营养琼脂平板上，36℃±1℃培养箱中培养48h±2h，从每一平板上选取至少一个良好分离的特征菌落，转接保存，进行鉴定10.3形态观察将挑选纯化的菌落做革兰氏染色镜检，饲用芽孢杆菌的菌落特征及染色镜检见表110.4生理生化鉴定将挑选纯化的菌落进行二乙酰（V-P）测定、糖发酵、明胶液化、丙酸盐利用和7%氯化钠生长试验。饲用芽孢杆菌的生理生化特征见表2。DB32/T2583-20135表1饲用芽孢杆菌的菌落特征与芽孢特征菌种菌落特征涂片镜检枯草芽孢杆菌（B.subulis）菌落表面粗糙，不透明，边缘扩张，圆形或蔓延成波浪形、不规则性，灰白色或微黄色细胞为杆状，有芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，革兰氏阳性地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）菌落杏仁白色，表面暗到粗糙，不透明，扁平，边缘不整齐呈毛发状细胞为杆状，单个、成对或短链排列，芽孢近椭圆形，中生，具有稀疏的周生鞭毛、能运动，芽孢囊稍膨大，革兰氏阳性凝结芽孢杆菌（B.coagulans）边缘整齐，不透明，白色有光泽细胞为杆状，单个、成对或短链排列，有芽孢，端生，革兰氏阳性短小芽孢杆菌（B.pumilus）菌落近似圆形，白色，边缘不整齐，不透去，表面光滑，湿润，呈长杆状，单生或成双成串生长，芽孢呈椭圆形中生，稍膨大，革兰氏阳性迟缓芽孢杆菌（B.lentus）菌落表面粗糙，不透明，灰白色细胞为杆状，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，革兰氏阳性侧孢芽孢杆菌（B.laterosporus）灰白色菌落，圆形、扁平、边缘光滑，中间稍呈轮状生长、蜡质、不产色素细胞为杆状，芽孢为椭圆形，侧生、中生或近中生，芽孢囊膨大，革兰氏阳性表2饲用芽孢杆菌的生理生化特征项目枯草芽孢杆菌B.subulis地衣芽孢杆菌B.licheniformis凝结芽孢杆菌B.coagulans短小芽孢杆菌B.pumilus迟缓芽孢杆菌B.lentus侧孢短芽孢杆菌B.laterosporus厌氧生长—++——+V-P测定+++———产酸L-阿拉伯糖++d++—D—木糖++d+++D-甘露醇++d++—水解明胶++—+d+淀粉+++—+—利用柠檬酸盐++d+——丙酸盐—+—+—ND硝酸盐还原++d—d+pH5.7生长++++——7%氯化钠生长++—+dd55℃生长—++———注：+表示90%以上菌株阳性；—表示90%以上菌株阴性；d表示11%-89%菌株为阳性；ND表示没有相关资料DB32/T2583-20131附录A（规范性附录）培养基及试剂A.1营养琼脂培养基A.1.1成分名称重量蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g～20g蒸馏水1000mLA.1.2制法加热溶解，校正pH至7.2±0.2，分装烧瓶，121℃高压灭菌20min。A.2革兰氏染色液A.2.1结晶紫染色液A.2.1.1成分名称重量结晶紫1.0g95％乙醇20mL1％草酸铵水溶液80mLA.2.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.2.2革兰氏碘液A.2.2.1成分名称重量碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300mLA.2.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.2.3沙黄复染液A.2.3.1成分名称重量沙黄0.25g95％乙醇10mL蒸馏水90mLA.2.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.2.4染色法DB32/T2583-20132A.2.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A.2.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。A.2.4.3滴加95％乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.2.4.4滴加复染液，复染1min。水洗、待干、镜检。A.3V-P测定A.3.1度培养基A.3.1.1成分名称重量蛋白胨5g葡萄糖5g氯化钠5g蒸馏水1000mLA.3.1.2制法溶解各成分与水中，必要时加热。调整pH使培养基为7.0±0.2，分装试管，115℃高压灭菌30min。A.3.2试剂名称重量肌酸0.3%或原粉氢氧化钠