DB32∕T 2608-2013 猪流行性乙型脑炎诊断技术

ICS65.020.30B22备案号：40494-2014江苏省地方标准DB32DB32/T2608-2013猪流行性乙型脑炎诊断技术DiagnosticTechniquesforJapaneseEncephalitisofSwine2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2608-2013前言为规范猪乙型脑炎诊断技术，特制定本标准。本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》进行编制。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：张雪寒、何孔旺、王小敏、郭容利、倪艳秀、李彬、温立斌、周俊明、俞正玉。DB32/T2608-20131猪乙型脑炎诊断技术1范围本标准规定了猪乙型脑炎的诊断技术。本标准规定的分离鉴定，间接免疫荧光技术和RT-LAMP法适用于本病的确诊，RT-LAMP适用于大批量样品的普查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T18638流行性乙型脑炎诊断技术NY/T541动物疫病实验室检验采样方法3流行病学诊断3.1易感动物多种动物可感染乙型脑炎病毒，多呈隐性感染，但可成为传染源。猪是乙型脑炎的重要传染源，不同年龄段的猪均能够感染，但临床症状有所不同。成年猪感染后可造成严重的生殖障碍。3.2易感季节本病的发生有明显的季节性，每年7-9月份发病率最高。3.3传播媒介蚊虫叮咬是乙型脑炎病毒传播的主要媒介。消灭传播媒介蚊虫是本病的主要预防措施。4临床诊断猪流行性乙型脑炎是一种发病率高死亡率低的繁殖障碍性传染病，临床症状为高热、沉郁或狂暴、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭和脑膜刺激症。感染乙脑病毒病猪症状主要表现为繁殖障碍:母猪表现为流产、死胎、木乃伊胎；公猪多表现为单侧睾丸炎，精液品质不良，失去配种能力。5病理学诊断公猪睾丸不同程度肿大，切面可见睾丸实质充血、出血，并有许多颗粒状的突起，有明显的黄色坏死灶。慢性病例睾丸内萎缩硬化，缩到如鸡蛋大，与阴囊粘连，睾丸实质大部分结缔组织化。流产母猪子宫内膜显著充血，粘膜上覆有粘稠的分泌物，膜面有少数小点状出血。子宫粘膜下组织水肿，胎盘呈炎性浸润。本死胎很少发生腐败。一般在体躯后部皮下有弥漫性水肿，全身肌肉退色，好像水煮肉。胸腔和心包常有积液，实质器官浊肿及散发小出血点。脑膜和脊髓硬膜有出血。DB32/T2608-201326病原学诊断6.1病毒分离6.1.1材料准备除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682—2008的灭菌二级水。PBS，DMEM，兔抗猪乙型脑炎病毒高免血清和健康兔血清。6.1.2病料采集按NY/T541规定的方法采样。疑似JE病例，流产胎儿、死胎、木乃伊胎等的脑组织，以及公猪精液和猪舍蚊子等靶组织样品。将猪脑组织或蚊子（50-100只/次）分别置于研钵中，加入PBS反复研磨，直至样品研磨成匀浆、组织碎片基本消失为止。将研磨液分装于1.5mLEP管中，-70℃冰箱反复冻融3次，4℃12000r/min离心5min，取上清液，经一次性滤器（孔径0.22μm）过滤后，-70℃保存备用。公猪精液的预处理仅是省去研磨过程，其他步骤与猪脑组织或蚊子的预处理一致。6.1.3细胞培养取培养至单层的BHK-21细胞，用PBS洗3次后，加入过滤的病料上清液1.0～1.2mL，37℃细胞培养箱中吸附1.5h，期间每隔20min轻摇细胞瓶1次。弃上清液，用PBS洗1次后加入2%维持液，置5%CO2、37℃细胞培养箱中培养3～5d，每天观察细胞病变（CPE）。如无CPE则于接毒后5d收毒，盲传3～5代。6.1.4乳鼠接种每只乳鼠脑内接种30.0μL或脑内兼腹腔各注射30.0μL过滤的病料上清，对照组脑内注射生理盐水30.0μL。每天观察小鼠精神状态2～3次，连续2～3周。待小鼠出现神经症状后（若无症状者则于接毒3周后）无菌剖取鼠脑，加入适量PBS研磨成乳液，反复冻融离心后，取上清液用0.22μm滤器过滤，再次接种乳鼠连续传代。6.2病毒鉴定6.2.1免疫荧光鉴定在24孔细胞培养板中接毒，培养48～72h后，弃原液，用PBS冲洗后加入-20℃预冷的丙酮，室温下固定10min；PBS冲洗，加入稀释好的猪JEV阳性血清，置37℃湿盒中孵育1h；PBS冲洗，加入已稀释的荧光素标记的兔抗猪抗体，37℃湿盒中作用1h；PBS冲洗后加入甘油缓冲液，于倒置荧光显微镜下观察。同时设阴性对照。6.2.2反转录-环介导等温扩增法（RT-LAMP）鉴定上述制备的病料，用商品化试剂盒提取RNA，作为RT-LAMP模板。根据JEV囊膜糖蛋白E基因6个特异性区域设计4条引物：F3和B3为外引物；FIP和BIP为内引物。F3：5′-CAACATTGCACGTCCGCAT-3′；B3：5′-AAGTCCACATCCGATGCC-3；FIP：5′-CCACCGTCGAGTTGTCAGTGACTTTTCGAAGCTAGCGAACTTGCT-3′；BIP：5′-CACGACTGGAGATGCGCACAATTTTCCCACGGTCACTGAAGCCTT-3′。外引物扩增产物为245bp。LAMP扩增产物在电泳图谱上表现为大小不一的梯状条带。RT-LAMP的扩增条件：65℃水浴锅中放置70min。优化后的反应体系中：含有0.2μMF3、B3，2μMFIP、BIP，0.8μMdNTPs，20mMTris-HCl（pH8.8），10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，6mMMg2+，0.1%TritonX-100，1.1mM甜菜碱，8UBST聚合酶，1UAMV反转录酶，再加入5μL的模板RNA。加入钙黄绿素荧光染料，肉眼观察结果，绿色，判为阳性，橙色，判为阴性。以1.5％琼脂糖凝胶电泳，出现梯状条带，判为阳性，无条带，判为阴性。并用建立的RT-LAMP方法扩增猪瘟（CSFV），蓝耳病毒（PRRSV），圆环病毒（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、细小病毒（PPV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、传染性腹泻病毒（PEDV）和轮状病毒（RV）以检验其特异性。DB32/T2608-201336.3结果判定以上实验为阳性，判为猪乙型脑炎病毒。7最终结论判定下列任何情况之一，均可判为猪乙型脑炎：7.1发病有明显季节性，并主要发生在夏季，以7-9月份为主、个体临床表现明显，病例解剖病变典型，用第6章中任何一种试验确诊为猪乙型脑炎病毒阳性者。7.2临床症状和发病情况不详，群体解剖检查病变典型，用第6章中任何一种实验确诊为猪乙型脑炎病毒阳性者。7.3发病情况、临床症状、病理变化不详，如用第6章中任何一种实验确诊为猪乙型脑炎病毒阳性者。`