DB32∕T 2561-2013 鹅坦布苏病毒的检测 RT-PCR 方法

ICS65.020.99B22备案号：40447-2014江苏省地方标准DB32DB32/T2561-2013鹅坦布苏病毒的检测RT-PCR方法MethodofRT-PCRdetectingGooseTembusuVirus2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2561-2013前言为规范鹅坦布苏病毒分子生物学检测技术，提高鹅坦布苏病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准的附录B为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：黄欣梅、李银、刘宇卓、赵冬敏、韩凯凯。DB32/T2561-20131鹅坦布苏病毒的检测RT-PCR方法1范围本标准规范了鹅坦布苏病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物序列、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于检测鹅脾脏和病毒细胞培养液中鹅坦布苏病毒核酸。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB16548—2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY/T541—2002动物疫病实验室检验采样方法3方法原理聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术以其快速、敏感和特异等优点在动物疫病检测中得到广泛应用，而且随着PCR技术的不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法表现出更准确、灵敏和特异的特点。本标准选取了鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5基因保守区域，设计了一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性试验、敏感性试验等，对鹅坦布苏病毒的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备PCR仪，离心机，电泳槽，微量移液器，凝胶成像系统。4.2主要试剂TRIZOL，氯仿，异丙醇，无水乙醇，焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水，AMV反转录酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，随机引物，RNA酶抑制剂，25mmol/LMgCl2，10×EXTaqDNA聚合酶Buffer，EXTaqDNA聚合酶，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，琼脂糖。5引物上游引物：5′-GCGGCTCAAGTGGGA-3′；下游引物：5′-CCTCGGTTGTTTGTTTCT-3′。6样品采集按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀发病鹅，无菌采集脾脏、肝脏、脑、肺脏、肾脏等组织置于－20℃保存，最好用脾脏进行检测。按照GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程，无害化处理病死鹅。DB32/T2561-201327方法步骤7.1样品处理取病料0.5g～1g按1:10加入DEPC（diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯）水，置研钵中剪碎并研磨，反复冻融研磨3次，将研磨好的组织以4℃12000r/min离心10min，取上清200µL备用。阴性对照：没有发病的正常鹅脾脏。阳性对照：鹅坦布苏病毒细胞培养物（见附录Ａ）。7.2GTMUVRNA的提取取已处理的待检样品，以GTMUV病毒细胞培养物为阳性对照，以正常脾脏作为阴性对照，无菌水为空白对照，每管依次加入Trizol600µL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃12000r/min，离心15min，取上层水相750µL，加入500µL异丙醇，混匀，-20℃放置15min，4℃12000r/min，离心10min，去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000r/min离心5min，去上清，室温干燥20min，加入DEPC水10µL，使之充分溶解。7.3RT-PCR7.3.1反转录反应5×AMVBuffer4μL，10mmol/LdNTPs2μL，随机引物1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，RNA模板10μL，AMV反转录酶1μL，H2O（DEPC处理）1.5μL，总体积为20μL，瞬间离心混匀，65℃反应15min，42℃孵育1h，95℃5min，同时设立阴性、阳性对照，产物于-20℃保存备用。7.3.2PCR的反应按25µL体系进行，含25mmol/LMgCl21.5µL，灭菌水15.75µL，反转录产物2.5µL，10×EXTaqDNA聚合酶Buffer2.5µL，2.5mmol/LdNTP1.5µL，上、下游引物50pmol/µL各0.5µL，EXTaqDNA聚合酶0.25µL。94℃3min，然后进入循环94℃30s，52℃30s，72℃40s，30个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。7.4电泳将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min，紫外灯下观察结果，并进行拍照。8结果判定阳性对照出现515bp扩增条带，同时阴性对照无此扩增条带时，试验成立。在试验结果成立的前提下，如果检测样品出现与阳性对照相同的515bp的扩增片段时，判定为该样品为鹅坦布苏病毒核酸阳性；否则判定为阴性。如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。DB32/T2561-20131附录A(规范性附录)阳性样品的制备为确保本标准的阳性样品能检测到特异性的目的条带，阳性样品按如下方法制备：首先，无菌采集新鲜GTMUV感染阳性鹅脾脏，用无菌的剪刀剪碎并称量，然后以质量比1:10加入DEPC（diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯）水，研磨成悬液，装入用DEPC处理过的离心管中，于－20℃反复冻融3次，以12000r/min，4℃离心10min，取上清接种于BHK-21细胞（仓鼠肾传代细胞），置37℃，5%CO2培养箱中培养，接种5天后将细胞及培养液反复冻融3次，收集细胞冻融液，连续盲传5代，收集细胞冻融液，4℃12000r/min离心10min，收集上清液，无菌分装，并进行病毒效价测定，病毒含量（TCID50）达到10-5/0.1mL以上，即可作为阳性对照，－70℃保存备用。DB32/T2561-20131附录B(规范性附录)RT-PCR扩增产物参考序列本标准参照的序列为GenBank上公布的GTMUVNS5基因保守区域序列(8322～8836bp)GCGGCTCAAGTGGGAATGTGACAAATAGTATCAATACAGTAAGCCAAATGCTGATCAACAGGATGCACAAAACCAACCGCAATGGACCCAGGTATGAAGAAGATGTGGACTTGGGTTCAGGGACCAGAGCTGTGAGCTGCACAAGACAGAGGACTGACTGGGGAATGGTCGCTGATAGGGTGAAGAATTTGGCCAGAGAATATGCTCCGTCTTGGCATTATGACCAAGACAATCCTTACAAGACTTGGAACTATCATGGAAGCTACGAAGTGAAAGCCACAGGCTCAGCCAGCTCAATGGTTAATGGGGTAGTTAGGATACTGTCAAAACCTTGGGACACCTTGCAAAACGTGGTAAATATGGCCATGACGGACACCACTCCTTTTGGGCAACAGCGCGTTTTTAAAGAAAAGGTTGATACCAAAGCCCCAGAACCACCTGCAGGAACAGCTAGGGTCATGAACATCGTGGCAAGATGGATGTGGAACTTTGTTGGCAGAAACAAACAACCGAGG