DB22T 1782-2013 布氏白僵菌粉剂生产技术规程

ICS65.100.10B65备案号：37440-2013DB22吉林省地方标准DB22/T1782—2013布氏白僵菌粉剂生产技术规程TechnicalregulationsforpowderproductionofBeauveriabrongniatii2013-04-01发布2013-06-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1782—2013I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由吉林省林业厅提出并归口。本标准起草单位：吉林市林业科学研究院。本标准主要起草人：张海军、陈玉宝、王有菊、王江、李茂军。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1782—20131布氏白僵菌粉剂生产技术规程1范围本标准规定了布氏白僵菌一级菌种生产，二级菌种生产，菌剂生产，菌剂干燥、粉碎、包装、储藏，及质量检验等技术内容。本标准适用于布氏白僵菌粉剂生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T25864-2010球孢白僵菌粉剂NY/T883-2004农用微生物菌剂生产技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1布氏白僵菌beauveriabrongniatii(Sacc.)Petch又名卵孢白僵菌，一种半知菌类的虫生真菌，分类上属于真菌门（Eumycota），半知菌亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hyphomycetes），丛梗孢目（Moniliaceae），丛梗孢科（Moniliaceae）、白僵菌属（Beauveria）。3.2原种stockculture习惯上称“母种”，由固体培养基培养保藏的原始纯化菌种。4一级菌种生产4.1培养基马铃薯200g切块（1cm×1cm×1cm）煮沸30min，过滤，取滤液，定容至1000ml，加入琼脂20g，全部溶解后加蔗糖或葡萄糖20g、牛肉膏1g、蛋白胨1g，煮至完全融化；用盐酸或氢氧化钠调解pH至5。4.2分装按每试管10ml定量分装至20mm×200mm试管中；用纯棉棉塞封盖试管口，松紧适度。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1782—201324.3灭菌试管直立于高压灭菌锅中，灭菌温度121℃～126℃，压力0.1Mpa～0.15Mpa，时间30min。4.4摆制斜面灭菌后，在无菌室的桌面上立即摆放斜面，原则是在培养基不湿棉塞的情况下，尽量延长培养基的斜面长度；斜面培养基凝固后即可接种。4.5接种在无菌条件下，取下原种试管和一级斜面培养基试管棉塞，酒精灯火焰烧灼试管管口3s～5s，用无菌接种针挑取原种25mm2～50mm2，接种于一级斜面培养基上，用接种针轻轻来回拉动2次～3次，在酒精灯火焰前，用原棉塞封盖试验管口。4.6一级菌种培养、保存在25℃恒温培养箱中培养10d～12d，观察剔除污染试管；保存在4℃～5℃冰箱中备用。4.7菌种复壮4.7.1复壮条件复壮条件应参照NY/T883-2004中4.1.5条执行。4.7.2复壮方法在暗室，30W紫外灯，距菌种表面30cm，照射30min，保持黑暗24h，重新接种。5二级菌种生产5.1培养料配制按麦麸、稻糠和谷糠5：3：2的比例混合，用0.1%KmnO4水溶液按与培养料质量比1：1的比例搅拌均匀。5.2分装将培养料装入600ml普通培养瓶，装瓶至容积的2/3，用耐高温聚丙烯塑料薄膜封口。5.3灭菌灭菌温度121℃～126℃，压力0.1Mpa～0.15Mpa，时间30min。5.4接种灭菌12h后，在超净工作台上，用无菌接种针，按每支一级菌种试管接7瓶～9瓶的数量，将一级菌种迅速移至二级瓶中，并封盖。5.5振荡接种后振荡，使培养料均匀散开并使菌种均匀分布于培养料内。5.6培养条件本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1782—20133在无阳光直射，23℃～25℃的条件下培养8d～10d。6菌剂生产6.1消毒培养室按5g/m3高锰酸钾加10ml福尔马林的用量，进行熏蒸消毒12h；培养盘及塑料薄膜浸入0.1%高锰酸钾水溶液中消毒1h，擦拭干净备用。6.2培养料配制同5.1。6.3培养料装袋装于规格为30cm×20cm耐高温聚丙烯菌袋中，每袋装培养料400g～500g，折叠袋口。6.4灭菌将培养料袋分层置于高压灭菌锅中，灭菌温度121℃～126℃，压力0.1Mpa～0.15Mpa，时间35min。6.5接种灭菌12h后，在无菌条件下，按每瓶二级菌接种1kg培养料充分混合进行扩繁。6.6装盘、培养培养盘下铺塑料薄膜，将培养料装入培养盘中，装至平盘，上盖塑料薄膜。置于无阳光直射23℃～25℃培养室的培养架上培养5d～6d。7菌剂干燥、粉碎、包装和储藏7.1干燥、粉碎在无阳光直射、通风的室内阴干或用恒温干燥箱30℃快速烘干；干燥的标准为含水率≤10%。采用40目筛片的电动粉碎机粉碎。7.2包装、储藏采用密封塑料袋封装，以每袋盛装菌剂5kg为宜，外套编织袋；在干燥、避光条件下储藏，8℃以下储藏期不超过6个月。8质量检验8.1抽样抽样方法应参照GB/T25864-2010中5.1条执行。8.2含水率测定含水率测定方法应参照GB/T25864-2010中5.5条执行。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1782—20134含水率标准为≤10%。8.3含孢量测定含孢量测定方法应参照GB/T25864-2010中5.3条执行。含孢量≥100亿/g。8.4活孢率测定准确称取蛋白胨0.5g、蔗糖0.5g、磷酸氢二钾0.1g，倒入250mL锥形瓶中，用蒸馏水定容至100mL，放入待测菌粉0.2g，振荡2min，将混合菌液滴在清洁的载玻片上，将载玻片放入垫有湿滤纸的培养皿中，置于25℃恒温箱中培养16h～20h，盖上盖玻片，600倍显微镜镜检；芽管大于孢子半径的孢子为萌发孢子；查数10个视野萌发芽孢子数和检查孢子总数；按（1）公式计算孢子萌发率：%100´=MNR.....................................(1)式中：R—孢子萌发率,%；N—萌发孢子总数；M—检查孢子总数。每个样品设3个重复，取3个重复均值作为该批次菌粉的活孢率。储藏期6个月时，活孢率≥80%。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1782—20135AA附录A（资料性附录）布氏白僵菌形态特征图表中名学名菌落特征菌丝特征孢子特征色素特征布氏白僵菌Beauveriabrongniatii(Sacc．)Petch表面乳白色至淡黄色，菌落茸毛状或棉絮状，培养的后期变为粉状。无色、透明、有横隔膜，直径为1.5μm—2.0μm。分生孢子椭圆形至亚圆形，直径2.0μm—6.0μm×1.5μm—3.0μm，生于产孢细胞顶端所延伸的“Z”字形丝状器上。使明胶培养基底部呈深红色至紫色；有的菌丝能使PDA培养基呈浅紫色。图A.1布氏白僵菌形态特征图表_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印