DB32∕T 2258-2012 ‘苏粉13 号’番茄种子纯度SRAP分子标记鉴定方法

ICS65.020.20B31备案号：37035-2013江苏省地方标准DB32DB32/T2258-2012‘苏粉13号’番茄种子纯度SRAP分子标记鉴定方法RulesforidentificationpurityoftomatosufenNo13usingSRAPmolecularmarkers2012-12-28发布2013-02-28实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2258-2012前言‘苏粉13号’番茄是江苏省农科院蔬菜所最新育成的高抗番茄黄化曲叶病毒病的杂种一代。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：赵丽萍、赵统敏、余文贵、杨玛丽。DB32/T2258-20121‘苏粉13号’番茄种子纯度SRAP分子标记鉴定方法1范围本标准规定了‘苏粉13号’及其亲本的品种纯度SRAP分子标记鉴定方法。本标准适用于‘苏粉13号’及其亲本的品种纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。GB/T3543.2-1995农作物种子检验规程扦样GB/T3543.5-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB16715.3瓜菜作物种子茄果类3术语、定义和缩略词下列术语和定义适用于本标准。3.1SRAPsequence-relatedamplifiedpolymorphism即相关序列扩增多态性，又叫基于序列扩增多态性，是基于PCR的标记系统。该标记通过17个碱基的正向引物和18个碱基的反向引物对开放读码框(oRFs)进行扩增。3.2品种纯度品种在DNA分子标记条带方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检测样品种子数的百分率表示。3.3引物结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。3.4内含子真核生物细胞DNA中的间隔序列即为内含子，是存在于真核生物基因中无编码意义而被切除的序列。3.5启动子是一段位于结构基因5＇端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合DB32/T2258-20122并具有转录起始的特异性。3.6缩略词下列缩略词适用于本标准。SRAP相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism)PCR聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction)DNA脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid)TBE三羟基氨基甲烷-硼酸一乙二胺四乙酸二钠（TrisBoric-acidEDTA)4原理SRAP标记均匀分布于番茄基因组中，该标记的正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子、启动子和间隔序列，而由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，从而扩增出SRAP多态性标记。不同番茄品种由于遗传结构的差异，经过一对或多对引物进行PCR扩增后会形成不同分子量大小的扩增产物，经染色形成不同番茄品种的电泳图谱，鉴定番茄品种纯度。5仪器设备及试剂5.1仪器设备PCR扩增仪；电泳槽；电泳仪；电子天平（感量0.01g，0.001g）；冰箱；微量加样器（10μl，100μl，200μl，1000μl）；恒温水浴锅（0℃-100℃），高速冷冻离心机；磁力搅拌器；高压灭菌锅；数码照相机等。烧杯；容量瓶（500ml，1000ml）；离心管（0.2ml，0.5ml，1.5ml，2ml）；吸头(10μl，200μl，1000μl)；注射器（100ml）；96孔PCR板；离心管架；染色盒等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；氢氧化钠(NaOH)；10倍PCR缓冲液（不含Mg2+）；液氮；三氯甲烷；异戊醇；氯化镁（MgCl2）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；TaqDNA聚合酶（5U/μl）；SRAP引物；矿物油；溴酚蓝；蔗糖；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；硫代硫酸钠；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液等。各种试剂配制见附录A。6引物筛选适宜引物应为扩增后的苏粉13号番茄SRAP电泳条带含有双亲条带，而且带型清晰、重复性好。取苏粉13号种子5粒及父母本种子各2粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。7方法步骤7.1样品制备从供检样品中随机取苏粉13号番茄种子200粒，播于穴盘中，待种子长出真叶时，随机选100株取叶片提取DNA。7.2DNA提取取幼嫩叶片放入1.5ml离心管中；加液氮，用事先准备好的枪头进行捣碎研磨；然后迅速加入500μl提取液，并在涡旋仪上涡旋混匀；放入水浴锅，30min左右，每隔5min上下颠倒摇匀；之后加入跟提取液等体积的氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，再静置3min左右；离心10min，12000r/min；提取上清液（枪头孔要剪大）再加冰冻过的等体积异丙醇，出现白色絮状沉淀；再冰冻10-30min，再离心，之后倒掉上DB32/T2258-20123清液，底部即是DNA，用75%的乙醇洗涤2次，吹干，加入200μl灭菌ddH2O。样品DNA溶液可以直接进行PCR扩增或在-20℃下保存。7.3扩增SRAP-PCR(10μl)反应体系：lxBuffer，引物各0.3μmol·L-1，dNTPs0.2mmol·L-1，Mg2+3.0mmol·L-1，o.6UTaqDNApolymerase，20ng模板DNA。PCR扩增反应程序：94℃3min；94℃1min，35℃lmin，72℃1.5min，5个循环；94℃lmin，50℃lmin，72℃l.5min，33个循环；72℃7min延伸；扩增产物在4℃保存。7.4检测7.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶制作将玻璃板洗净，晾干后装玻璃板于胶条上，取30%Arc:Bis11.97ml，5×TBE9ml，ddH2O23.4ml，加入36µlTEMED和540µl10%AP溶液，轻轻摇匀。将凝胶溶液均匀倒入两块玻璃板中间，将梳子垂直插入胶中（注意防止灌胶过程中产生气泡），使其聚合1h以上，让其充分凝固。7.4.2预电泳拔下梳子，倒入1×TBE缓冲液，90V稳压下预电泳30-60min。7.4.3点样扩增产物加3µl溴酚蓝加样缓冲液，混匀，每加样孔点样量4µl。7.4.4电泳120V稳压下电泳2h。7.4.5染色电泳完毕后将玻璃板从电泳槽中取出，剥下凝胶；将凝胶放入固定液中固定15-20min，用蒸馏水漂洗2次，每次约1min；然后将凝胶放入染色液中染色15-20min，用蒸馏水快速漂洗2次，每次不超过10s；然后将凝胶放入显色液中，轻轻晃动，待条带清晰后，用蒸馏水漂洗2次，放在灯箱上记录结果，拍照保存。8数据统计与计算如果苏粉13号SRAP位点表现双亲带型，说明品种纯合；如果出现单个亲本带型或其他带型，认为该种子为假杂种。品种纯度（P）的数值以%表示，按公式（1）计算：式中：P—品种纯度；Nr—N1—检测种子数；N2—非双亲带型种子数。9鉴定报告苏粉13号番茄纯度鉴定报告见表1。P=NrN2/N1×100%……………………………………………………………………………….（1）DB32/T2258-20124表1年苏粉13号番茄SRAP标记纯度鉴定表品种名称检测种子数非双亲带型种子数品种纯度%取样日期：鉴定地点：鉴定日期：鉴定技术负责人（签字）：DB32/T2258-20125附录A（资料附录）主要试剂配制A.110mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液：取NaOH80g，先用160mlddH2O溶解后，定容至200ml。A.20.5mol/LEDTA（pH8.0）：取EDTA-Na2186.1g倒入1000ml烧杯中，加入800mlddH2O溶解，用固体氢氧化钠调节pH至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。A.31mol/LTris-HCl（pH8.0）：取三羟甲基氨基甲烷(Tris)60.55g倒入500ml烧杯中，加入400mlddH2O溶解，用盐酸(HCl)调pH至8.0，定容至500ml，高压灭菌。A.4TE缓冲液（pH2.0）：取1mol/LTris-HCl（pH8.0）5ml和0.5mol/LEDTA（pH8.0）1ml，用盐酸(HCl)调pH至2.0，加ddH2O定容至500ml，高压灭菌。A.5CTAB提取液：称取氯化钠（NaCl）40.9g，倒入500ml烧杯中，加200mlddH2O溶解，加1mol/LTris-HCl（pH8.0）50ml，加0.5mol/LEDTA（pH8.0）20ml，加十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）10g，加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5g，用ddH2O定容至500ml。4℃条件保存，用前加β-巯基乙醇（β-Me）5ml。A.6SRAP引物：用灭菌ddH2O分别配制正向引物（F）和反向引物（R）终浓度均为100µmol/L的储存液，取10µl储存液加入490µl灭菌ddH2O配成2µmol/L工作液。A.7三氯甲烷/异戊醇（24:1）：取2400ml三氯甲烷和100ml异戊醇，混匀。A.8加样缓冲液：取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖，倒入200ml烧杯中，用ddH2O定容至100ml。A.950×TBE缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）54g，硼酸27.5g，倒入1000ml烧杯中，加入800ml蒸馏水溶解，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）20ml，定容至1000ml。A.101×TBE缓冲液：取100ml50×TBE缓冲液，加蒸馏水4500ml，混匀。A.1130%Arc:Bis：取10g甲叉双丙烯酰胺（Bis）溶于600mlddH2O中，搅拌至溶解后，加入290g丙烯酰胺（Arc），搅拌至溶解，定容至1L，4℃保存。A.1210％过硫酸铵（10%AP）：取1g过硫酸铵，加10mlddH2O溶解，4℃下保存（保存期不超过7d）。A.13硫代硫酸钠溶液（10mg/ml）：取1g硫代硫酸钠，加100mlddH2O溶解。A.14固定液取20ml100%乙醇，1ml冰醋酸，加蒸馏水定容至200ml。A.15染色液取硝酸银2g，加蒸馏水定容至200ml。A.16显色液取氢氧化钠3g，加200ml蒸馏水溶解，再加甲醛2ml和50µl硫代硫酸钠溶液，加蒸馏水定容至200ml。