DB32∕T 1848-2011 水稻转基因实验室安全操作规程

ICS65.020.01B09备案号：31248-2011江苏省地方标准DB32DB32/T1848—2011水稻转基因实验室安全操作规程RulesofLab-safetyOperationfortheEngineeringGeneTransformationinRice2011-08-15发布2011-10-15实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1848—2011I前言水稻是重要的粮食作物。转基因技术可用于水稻的遗传改良。水稻转基因的实验室安全操作目前尚无国家标准、行业标准。随着国内外稻米市场质量安全准入制度的实施，为规范水稻转基因实验室安全操作技术，保证转基因技术应用的生物与环境安全，特制定本标准。本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准结构和编制》的要求编写。本标准技术指标符合如下标准的有关规定：GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求SN/T1834—2006出入境口岸疾病监测实验室生物安全操作标准本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏农业科学院粮食作物研究所。本标准主要起草人：杨杰、仲维功、范方军、陈志德、王军。DB32/T1848—20111水稻转基因实验室安全操作规程1范围本标准规定了安全等级为I级的转基因水稻实验室安全操作标准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本部分。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本部分。GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求。SN/T1834—2006出入境口岸疾病监测实验室生物安全操作标准。3术语和定义3.1生物安全Biologicalsafety避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施。3.2转基因技术Transgenetechnology将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。3.3聚合酶链式反应Polymerasereaction模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。4水稻转基因过程4.1农杆菌介导转化法将目的基因插入到经过改造的T-DNA区——借助农杆菌的感染实现外源基因向水稻细胞的转移与整合——通过细胞和组织培养技术，再生出转基因水稻。4.2基因枪介导转化法DB32/T1848—20112利用基因枪将带目的基因的DNA溶液送入完整的水稻组织和细胞中——细胞和组织培养技术，再生出水稻植株——选出转基因阳性水稻植株，即为转基因植株。5水稻转基因实验室安全基本操作技术5.1实验仪器安全操作5.1.1离心机的安全操作使用实验室离心机时，应仔细检查使仪器的机械性能处于正常状态。离心机放置的高度应使工作人员能够看到离心机内部，以正确放置十字轴和离心桶。离心管和盛放离心标本的容器应由厚壁玻璃（塑料）制品制成，并且在使用前应检查有无破损。离心的试管和标本容器应用螺旋盖牢固盖紧。离心桶的装载、平衡、密封和打开应在生物安全柜内进行。离心桶和十字轴应按质量配对，并在装载离心管后正确平衡。操作指南中应给出液面距离心管管口需要留出的空间大小。空离心桶应用蒸馏水或乙醇（异丙醇，70%）平衡。禁止使用盐酸溶液或次氯酸钠溶液平衡。使用固定角离心转子时，离心管不能装的过满，以防漏液。应检查离心机内转子部位的腔壁有无被污染。应检查离心转子和离心桶腐蚀或细微裂痕。每次使用后，应清除离心桶、转子和离心机腔的污染。使用后应将离心桶倒置存放使平衡液流干。使用牢固加盖的离心管，防止感染性气溶胶和可扩散粒子的产生。5.1.2匀浆器、摇床、搅拌器和超声处理器的安全操作应使用实验室专用搅拌器和消化器。盖子、杯子或瓶子应保持正常状态，无裂缝或变形。盖子应能封盖严密，衬垫应处于正常状态。应使用塑料容器，聚四氟乙烯容器。避免含有感染性物质的气溶胶从盖子和容器间隙逸出（玻璃破碎而释放感染性物质，伤害操作者）。使用匀浆器、摇床和超声处理器时，应采用结实透明的塑料箱覆盖。操作结束后，应在生物安全柜内打开容器。对使用超声处理器的人员应提供听力保护。5.1.3电泳系统确定电泳仪的电源开关处于关闭的状态。连接电源线，确定电源插座有接地保护。将黑红两种颜色的电极线对应插入仪器输出插口，并与电泳槽相同颜色插口连接好。确定电泳槽中的试剂配置是否符合要求。打开开关，根据实验需求调节电流或电压。在电泳进行期间，避免身体和电泳液接触，以免触电。如发现异常情况（如出现异味），应立即关闭检查。点用完毕后，关闭电源，将电极从电泳槽拔除。5.1.4凝胶成像系统开启电脑操作系统。DB32/T1848—20113打开成像系统程序，确认紫外灯处于关闭的状态。打开暗箱门，将样品放入。打开可见光，调节位置。关闭暗箱门，打开紫外灯，调节成像参数，获得图像信息。存储图像。关闭紫外灯，取出样品，清洁暗箱。关闭电脑。5.1.5基因枪基因枪的操作过程须在无菌条件下进行，基因枪所处的位置及超净工作台在使用前用紫外灯灭菌1.5小时。用70%的乙醇对基因枪表面及样品室进行消毒，同时用70%的乙醇将阻挡网、固定器浸泡15分钟，对裂解膜用70%的异丙醇浸一下，不要超过3秒，微弹载体用70%乙醇浸一下放在超净工作台上阴干。取微粒载体，用厂家提供的嵌入工具将其固定在钢碗底部环内，取DNA与金粉混合物，用加样枪吸取一定量加于微载体中央，干燥2分钟。安装可裂解膜于其托盘上，顺时针安装到加速器上，用厂家提供的专用扳手适当用力固定。将空间环、阻挡网、阻挡网托盘、微粒载片及固定环（带有微粒面朝下）安好，旋紧插入枪体中。被轰击样品，根据参数距离放入轰体室合适的位置，关好轰击室门。打开氦气瓶总阀门，顺时针调节气压。一般氦气压调节标准是高于实验用可裂膜压力=1.379MPa。打开基因枪面板左侧电源开关。将中间气流控制开置于“VAC”位，待真空度达到实验要求时[如28in(1in=2.54cm)汞柱=94.82kPa]，快速按下此开关到保持位“HOLD”。右侧发射开关只有真空压力达到5in汞柱以上方才点亮。向上压住发射键“FIRE”保持不动，直到轰击为止。将中间位置气流控制开关置于“VENT”位通气，等待真空表回零后取出样品。关机。把氦气瓶总开关旋紧，打一次空枪，等待氦气压表（两个表）指针回零后，逆时针旋转氦气压表调节阀至最小，关闭基因枪电源。5.1.6冰箱和冰柜冰箱、低温冰箱和冰柜应当定期除霜和清洁，应清理出所有在储存过程中破碎的安瓶和试管等物品。清理时应戴上厚的橡胶手套并进行面部防护，清理后要对内表面进行消毒。储存在冰箱内的所有容器应当清楚地表明内装物品的科学名称、储存日期和储存者的姓名。未标明的或废旧物品应当高压灭菌并丢弃。应当保存一份冻存物品的清单。除非有防爆措施，否则冰箱内不能放置易燃溶液。冰箱门应注明这一点。5.1.7生物安全柜的安全操作操作者应牢记，当出现液出、破损或不良操作时，安全柜不具有保护操作者的作用。生物安全柜运行正常时，才具有保护操作者的作用。生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。生物安全柜内少放置器材和标本，不应影响后部压力排风系统的气流循环。生物安全柜内不应使用本生灯，防止燃烧产生的热量干扰气流、损坏过滤器，应使用微型电热器（一次性无菌接种环）所有工作应在工作台面的中后部进行，并能通过玻璃观察挡板观察。应减少操作者身后的人员活动。DB32/T1848—20114操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。不应使实验记录本、移液管以及其他物品阻挡空气格栅，以免干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。工作完成后及下班前，应用消毒剂对生物安全柜的表面进行擦拭。生物安全柜内的工作开始前和结束后，安全柜的风机应运行5分钟以上。在生物安全柜内操作时，不应进行文字操作。5.2水稻转基因实验室安全操作规程实验时，未经实验室主任同意，限制或禁止进入实验室。不许在工作区域饮食、吸烟、洗隐形眼镜和化妆。不许用嘴移液，只能用机械装置移液。所有操作过程应尽量细心，避免产生溅出和气溶胶。实验完毕、下班前、活体溅出或溢出时，都应使用对病原有效的消毒剂进行台面消毒。所有的培养物、储存物及其他规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。离开该系统进行消毒的材料，在转移前应包装，其包装应符合相关法规。必须给实验室工作人员配备必要的个人防护用品。5.3水稻农杆菌介导转化法5.3.1无菌受体材料的准备取自田间或温室栽培水稻植株：幼穗、去壳成熟种子用蒸馏水冲冼1遍后，70％乙醇洗45秒，0.1％升汞消毒6-8分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。5.3.2受体材料预培养将无菌的花药或种子接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养。培养基的配制见附录（1）。5.3.3农杆菌培养从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃,180r/min培养至OD600为0.6-0.8。取OD600为0.6-0.8的菌液，按1％-2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6小时左右，OD600为0.2-0.5时即可用于转化；或同时加入100-500μmol/的AS。5.3.4侵染于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。从培养瓶中取出预培养过的愈伤组织，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1-5分钟，不同材料处理时间不同）。取出愈伤组织置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。侵染后剩余的农杆菌液以及吸附农杆菌的滤纸放入10%次氯酸钠溶液浸泡半小时以上，灭杀农杆菌。5.3.5共培养将侵染过的愈伤组织接种在诱导培养基上，在28℃暗培养条件下共培养2-3天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养）。DB32/T1848—201155.3.6选择培养将经过共培养的外植体转移到加有选择压（以Hph为标记基因时一般使用潮霉素）的脱菌（附加250-500mg/L的羧苄青霉素或头孢霉素，抑制农杆菌生长）分化或愈伤组织诱导培养基上，在光照为2000-10000lx、25℃条件下进行选择培养。5.3.7继代选择培养选择培养2-3周后，愈伤组织的转化细胞将分化出抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分化培养基中令其生长或诱导分化。明显褐化或剩余的其他愈伤组织利用专用垃圾袋保存，121℃灭菌处理。5.3.8生根培养待苗长到2cm以上时，在有选择压的生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。5.3.10转基因苗的处理转基因材料要干燥后烧毁或进行高压灭菌处理。6实验室清洁6.1清洁用具不同实验区域的清洁用具应固定，不能交叉使用。工作结束后应立即对工作区域进行消毒。6.2清洁方式6.2.1实验室空间实验室空间应定期进行紫外照射。6.2.2实验室台面和仪器设备的清洁实验结束后，实验台面、超净工作台宜用3%的双氧水或10%次氯酸钠溶液（含有效氯1g/L）擦拭清洁，也可在擦拭后再用紫外光照射，照射距离应不超过90cm，照射时间宜过夜。注：10%次氯酸钠和3%的双氧水应在使用前配置，配置好的溶液不宜长期存放。7有毒、有害及废弃物质的处理7.1移液器吸头使用过的移液器吸头应放入含有10%次氯酸钠溶液内浸泡，浸泡时间不宜少于24小时。7.2PCR产物含有PCR产物的所有液体及废弃物都应放入含有1mol/L盐酸（HCl）的容器中浸泡，浸泡时间不宜少于6小时。7.3琼脂糖凝胶及电泳液对含有EB或经EB浸泡过的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液的处理参见附录2。DB32/T1848—201168致癌物及其实验室安全守则致