WST 564-2017 巴贝虫病诊断

ICS11.020C61WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T564—2017巴贝虫病诊断DiagnosisofBabesiosis2017-08-01发布2018-02-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布WS/T564—20171前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准起草单位：上海市寄生虫学会、复旦大学、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、中国医学科学院医学实验动物研究所、复旦大学附属华山医院、浙江省疾病预防控制中心、中国农业科学院上海兽医研究所。本标准主要起草人：陈家旭、程训佳、许学年、秦川、张文宏、姚立农、周金林、魏强、陈韶红、郑彬、陈木新。WS/T564—20172巴贝虫病诊断1范围本标准规定了巴贝虫病的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。本标准适用于各级医疗机构和疾病预防控制机构对巴贝虫病的诊断。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1巴贝虫Babesia.spp寄生在人和脊椎动物红细胞内的原虫，感染人的主要有田鼠巴贝虫（Babesiamicroti）、分歧巴贝虫(B.divergens)、邓肯巴贝虫（B.duncani）、猎户巴贝虫（B.venatorum）等（参见附录A）。2.2巴贝虫病babesiosis/babesiasis由巴贝虫感染引起的一类人兽共患寄生虫病，主要经蜱传播。2.3无症状感染者asymptomaticcase无临床症状的巴贝虫感染者。2.4重症巴贝虫病severebabesiosis巴贝虫病确诊病例，出现高热、重度贫血、黄疸、血红蛋白尿、呼吸窘迫、肾功能衰竭、昏迷等一项或多项临床表现。3诊断依据3.1流行病学史有野外活动、蜱叮咬、输血或器官移植史（参见附录B）。3.2临床表现3.2.1常见临床表现：寒战、发热、出汗、乏力、恶心、食欲减退、肌肉疼痛、关节疼痛、头痛、腹痛、贫血等（参见附录C的C.1）。WS/T564—201733.2.2重症临床表现：高热、重度贫血、血红蛋白尿、黄疸、呼吸窘迫、肾功能衰竭、昏迷等(参见附录C的C.2)。3.3实验室检查3.3.1血涂片镜检查见巴贝虫（见附录D的D.1）。3.3.2巴贝虫核酸检测阳性（见附录D的D.2）。3.3.3巴贝虫抗体检测阳性（见附录D的D.3）。3.3.4动物接种巴贝虫阳性（见附录D的D.4）。4诊断原则根据流行病学史、临床表现以及实验室检查结果予以诊断。5诊断5.1无症状感染者无明显临床症状和体征，并同时符合3.3.1、3.3.2和3.3.4中任一条。5.2疑似病例符合3.1，并同时符合3.2中任一条。5.3临床诊断病例疑似病例并同时符合3.3.3。5.4确诊病例临床诊断病例或疑似病例，并同时符合3.3.1、3.3.2和3.3.4中任一条。5.5重症病例确诊病例，同时符合3.2.2。6鉴别诊断临床诊断病例应与以发热为主要症状的其他疾病，如疟疾、莱姆病、恙虫病、黑热病、登革热、败血症等相鉴别（参见附录E）。WS/T564—20174AA附录A（资料性附录）病原学A.1分类巴贝虫属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoa）、梨形虫亚纲（Prioplasmasina）、梨形虫目（Piroplasmida）、巴贝虫科（Babesiidae）、巴贝虫属（Babesia）。目前已鉴定的有100多种巴贝虫，可以感染牛、马、羊、犬等多种哺乳动物和鸟类。能感染人体的巴贝虫主要有田鼠巴贝虫(Babesiamicroti)、分歧巴贝虫(B.divergens)、邓肯巴贝虫（B.duncani）、猎户巴贝虫（B.venatorum）等。A.2形态巴贝虫在红细胞内形态多样。常见虫体形态有环形、圆形、杆形、点状、梨形、阿米巴形等。典型形态为梨形，常在一个红细胞内有多个虫体寄生，以1~4个虫体居多，可形成三联体，或四联体型，即马耳他十字形；且可为不同发育时期的虫体。经瑞氏或吉氏染色后，胞浆呈蓝色，核呈红色。根据虫体大小分为：大型巴贝虫，体长2.5μm~5μm，如分歧巴贝虫；小型巴贝虫，体长1.0μm~2.5μm，如田鼠巴贝虫。A.3生活史巴贝虫的生活史主要包括在人或脊椎动物红细胞内的发育阶段和媒介蜱体内发育阶段。巴贝虫的子孢子通过蜱叮咬随唾液进入人或脊椎动物体内，侵入红细胞后，通过出芽生殖方式或二分裂增殖发育成裂殖子。随着红细胞破裂，裂殖子释放后，再侵入新的红细胞，重复分裂增殖。部分虫体不再进行裂体增殖，而发育成雌雄配子体。配子体通过蜱吸食宿主血液进入蜱体内，在肠道中发育为配子，进而结合成合子，然后进行增殖，再通过血淋巴移行至蜱体内各个组织。移行到蜱唾液腺的合子，进一步发育为子孢子，完成一个生活周期。巴贝虫在蜱间传播方式有：①经卵传递：雌蜱吸血后，巴贝虫在蜱体内繁殖发育后，进入蜱卵巢，经卵传递给下一代蜱。②期间传播：幼蜱（或若蜱）吸食含有巴贝虫的血液后发育，将虫体传给下一个发育阶段。WS/T564—20175BB附录B（资料性附录）流行病学B.1传染源感染巴贝虫的人和社鼠、褐家鼠、黄胸鼠、黑线姬鼠等啮齿类，及牛、鹿、犬、浣熊、鸟类等动物。B.2传播途径经蜱叮咬、输血或器官移植等途径传播。B.3易感人群人对巴贝虫普遍易感。B.4地区分布B.4.1国外分布巴贝虫呈世界性分布，自1888年罗马尼亚科学家Babes首次从病牛红细胞中发现双芽巴贝虫（Babesiabigemina）以来，已鉴定报道100余种，但感染人体的主要有田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、邓肯巴贝虫和猎户巴贝虫等数种。1957年南斯拉夫学者报道了首例人体巴贝虫感染病例之后，美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲等均有巴贝虫感染病例报道，以美洲、欧洲地区为多。美国自2011年将巴贝虫病作为法定传染病报告以来，每年报告约1000例感染者，主要流行虫种为田鼠巴贝虫。而欧洲地区报道病例略少，主要流行虫种为分歧巴贝虫、猎户巴贝虫和田鼠巴贝虫。近年来，埃及、墨西哥、南非、莫桑比克、澳大利亚、巴西、日本、韩国等相继报道了人感染巴贝虫的病例。B.4.2我国分布我国首次人体巴贝虫感染病例报告可追溯到1944年，洪式闾对重庆地区一例疑似疟原虫感染者的血涂片检查时，根据原虫形态特征分析判定，该患者为巴贝虫感染。至今，我国已报告病例约100例，病例报告地区包括黑龙江、云南、重庆、广西、上海、新疆、浙江、内蒙古、山东及台湾等，报道病例较多的地区为黑龙江和云南。我国分布虫种主要是田鼠巴贝虫、猎户巴贝虫和分歧巴贝虫，南方以田鼠巴贝虫为主，北方则以猎户巴贝虫为主。多数病例发病集中在夏季，可能由于该季节是蜱虫活动的高峰期，易引起人的感染。在我国文献报道病例中少数患者有明确的蜱虫叮咬史、手术输血史，有些患者无明确的感染方式。WS/T564—20176CC附录C（资料性附录）临床表现C.1常见临床表现巴贝虫病的临床表现与无性繁殖期巴贝虫破坏红细胞程度及宿主免疫状态有关，其潜伏期1周～4周。免疫功能正常者多呈自限性，症状可持续2周～4周。症状包括寒战、发热、出汗、乏力、恶心、食欲减退、肌肉疼痛、关节疼痛、头痛、腹痛、贫血或血红蛋白尿等。C.2重症临床表现重症患者起病急，多发生于脾切除、老年体弱及免疫功能低下患者。病人可出现高热（体温可达40℃）、重度贫血、血红蛋白尿、呈酱油色尿、黄疸、呼吸窘迫、肾功能衰竭或昏迷，甚至死亡。病人肝功能异常。WS/T564—20177D附录D（规范性附录）实验室检查D.1血涂片镜检D.1.1血涂片的制作用一次性采血针在耳垂或指端采血，婴儿可从拇趾或足跟采血。取血在表面洁净、无刮痕的载玻片上涂制薄血膜。用推片中部刮取血液1.0μL～1.5μL，将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两张玻片保持25º～35º角，迅速推成舌状薄血膜。D.1.2染色D.1.2.1吉氏染色染色前先用甲醇固定血膜。成批染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对载玻片血膜朝外插入染色缸中，倒入新配制的2％吉氏染液(2mL吉氏原液与98mL蒸馏水或PBS缓冲液混匀）浸没薄血膜，30min后，向染色缸中注入自来水或PBS缓冲液至溢出，除掉染液表面浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2～3次，然后取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上晾干。单张血膜染色可取PBS缓冲液2mL加入吉氏染液1～2滴，混匀后滴在薄血膜上，20min～30min后，水洗、晾干。D.1.2.2瑞氏染色在薄血膜上加瑞氏染液5～8滴，固定染色1min～2min。然后再加5～8滴蒸馏水于血膜上，用吸管将染液与蒸馏水混合均匀，染色3min～5min后，用清水轻轻冲去染液，晾干。D.1.3血涂片检查染色后的血膜用光学显微镜检查。经瑞氏或吉氏染色后，巴贝虫胞浆呈蓝色，核呈红色。常见虫体形态有环形、圆形、杆形、点状、梨形、阿米巴形、马耳他十字等。检查到上述形态的巴贝虫为阳性。D.2巴贝虫核酸检测D.2.1样本处理采取核酸提取试剂盒或其他基因组DNA提取方法提取巴贝虫DNA。D.2.2试剂组成血液基因组DNA提取试剂盒和PCR扩增试剂盒。D.2.3操作步骤和结果判读D.2.3.1引物序列采用巢氏PCR方法从患者红细胞中检测巴贝虫18SrRNA特异性基因。引物序列如下:WS/T564—20178引物名称引物序列Bab5（第一轮上游引物）5′-AATTACCCAATCCTGACACAGG-3′Bab8（第一轮下游引物）5′-TTTCGCAGTAGTTCGTCTTTAACA-3′Bab6（第二轮上游引物）5′-GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA-3′Bab7（第二轮下游引物）5′-CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC-3′D.2.3.2第一轮扩增以引物Bab5和Bab8进行第一轮扩增，反应体系为50μL：Taq酶5U/μL0.25μL10×buffer5μLdNTP4μLBab520μmol/L1.5μLBab820μmol/L1.5μLDNA模板2μLddH2O35.75μLPCR过程为：95℃5min；95℃45s，55℃45s，72℃1min共35个循环；72℃7min。D.2.3.3第二轮扩增取PCR产物2μL，以Bab6和Bab7进行第二轮扩增，反应体系为50μL：Taq酶5U/μL0.25μL10×buffer5μLdNTP4μLBab620μmol/L1.5μLBab720μmol/L1.5μLPCR产物2μLddH2O35.75μLPCR过程为：95℃5min；95℃45s，55℃45s，72℃1min共35个循环；72℃7min。将第二轮的PCR产物进行电泳，确认片段大小约为400bp的特异片段。PCR产物经割胶回收后，连入载体，进行克隆并测序分析，确定巴贝虫感染。D.3巴贝虫抗体检测D.3.1方法采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法，检测人血清、血浆或其他体液样品中的巴贝虫IgG（或IgM）抗体。WS/T564—20179D.3.2试剂组成巴贝虫诊断抗原（5μg/mL~10μg/mL）包被的96微孔板、葡萄球菌蛋白A（SPA）或抗人IgG（或IgM）酶标结合物、洗涤液（含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液）、稀释液（含有1％牛血清白蛋白的洗涤液）、终止液（主要成分为2mol/L硫酸溶液）、底物A液（主要成分为过氧化氢）、底物B液（主要成分为四甲基联苯胺）、阳性对照和阴性对照。D.3.3操作步骤在盛有0.5mL稀释液的1.5mL塑料离心管或稀释板孔中，加入5μL待检测样混匀。在包被巴贝虫抗原的96微孔板中加入稀释的待检样品100μL（复孔检测），设阳性对照2孔，阴性对照2孔，并设空白对照2孔，置37℃孵育30min。随后弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次间隔1min，甩干。除空白对照孔外，每孔加入酶标结合物50μL，37℃孵育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次间隔1min，甩干。每孔依次加入底物A液、底物B液各50μL，轻叩微孔板混匀，37℃避光放置5min～10min。每孔加入终止液50μL。D.3.4结果判