人工酶

人工模拟酶artificialenzyme目录一、人工酶的概念二、人工酶的发展简史三、人工酶的理论基础四、人工酶的分类与介绍一、人工酶的概念•人工（模拟）酶（artificialenzyme）：根据酶的催化原理，模拟酶的生物催化功能，用有机化学和生物学的方法合成具有专一催化功能的物质二、人工酶的发展简史•1970年，第一个以环糊精为基本结构的模拟酶诞生•从1970s开始，Breslow课题组对模拟酶进行了大量研究，取得丰硕的成果，为人工酶的设计和应用作出了巨大贡献RonaldBreslow(1931-)•1967年，Pedersen报道了冠醚与碱金属离子的配合物•1973年，Cram提出“主-客体化学”的概念•1978年，Lehn引入术语“超分子化学”来定义“分子间组装体和分子间作用力的化学”——1987年，上述三人共同获得诺贝尔化学奖–分子印迹技术与人工酶•1972年，Wulff研究组制备出第一个分子印迹聚合物•1987年，Mosbach研究组制备出第一个分子印迹酶，用于对硝基苯基酯类的水解•目前对人工酶的研究已经涵盖了六大类酶，已设计并制备出的人工酶多达数千种三、人工酶的理论基础•酶学基础：酶的结构和酶学性质。•“主-客体”化学(Host—GuestChemistry)：主体有选择地识别客体并与之通过弱相互作用力形成稳定复合物的化学领域•超分子化学（supramolecularchemistry）：研究两种或两种以上的化学物通过分子间力（静电作用、氢键、范德华力等非共价键）相互作用缔结而成的具有特定结构和功能的超分子体系的科学四、人工酶的分类–人工酶的分类——Kirby分类法•单纯酶模型（enzyme-basedmimics):以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性•机理酶模型（mechanism-basedmimics）:通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成•单纯合成的酶样化合物（Synzyme）:化学合成的具有类似于酶催化活性的简单分子–人工酶的分类——按属性分类•主－客体酶和酶模型(由大环及带空穴的化合物构成的超分子主－客体结构)•胶束酶模型(将催化基团连接在胶束上，提供“活性中心”)•肽酶•半合成酶•分子印迹酶(以某一分子为模板，周边聚合交联后，除去模板留下特定形状空穴)•抗体酶具有催化作用的人工构建的抗体–基于主－客体结构的酶模型•环糊精酶模型•大环及穴状配合物酶模型–胶束人工酶–分子印迹酶–肽酶人工酶的介绍主－客体酶模型环糊精（cyclodextrin，CD）酶模型•环糊精：是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称•相邻葡萄糖基之间通过-1,4-糖苷键连接•常见的环糊精主要有-、-和-CDOOHHOOHOOOHHOOHOOOHOHOHOOOOHOHHOOOHHOHOOOOHHOHOOOOHHOOHOOOHHOOHOOOHOHOHOOOHOHHOOOOHOHHOOOOHOHHOOOOHHOHOOOOHHOOHOOOHHOOHOOOHOHOHOOOHOHOHOOOHOHHOOOHOHHOOOOHHOHOOOOHOHHOOO-cyclodextrin-cyclodextrin-cyclodextrin主－客体酶模型环糊精酶模型•环糊精的分子呈截锥形•所有的羟基—OH构成环糊精的亲水表面•碳链骨架构成了环糊精的疏水内空腔环糊精酶模型——酰基水解酶（acyl-hydrolase）•1970年，Breslow设计出第一个环糊精酶模型，能催化对硝基乙酰苯酯的水解，反应速率比无催化剂时快103倍环糊精酶模型——转氨酶（transaminase）•转氨酶以维生素B6（吡哆醛/吡哆胺）为辅酶，催化氨基在氨基酸和酮酸之间转移•维生素B6通常以磷酸化的形式参与转氨酶的催化反应•维生素B6自身即能实现转氨基作用，但缺乏底物结合位点，高效的转氨酶模型必须具有合适的底物结合部位，环糊精的空腔能够为底物提供良好的结合位点•1980年报道了第一个人工转氨酶模型，它具有良好的底物选择性，可以使反应加速200倍主－客体酶模型大环及穴状配合物酶模型人工合成的宿主分子，具有酶模型的特性。如冠醚、穴醚、环番、杯芳烃等大环多齿配体。具有底物识别能力和催化基团。•冠醚最大的特点就是能与正离子，尤其是与碱金属离子络合，并且随环的大小不同而与不同的金属离子络合。•例如，安息香在水溶液中的缩合反应产率极低，如果在该水溶液中加入7％的冠醚，则可得到产率为78％的安息香；若上一反应在苯（或乙腈）中进行。如果加入18－冠－6，产率可高达95％。杯芳烃•1942年金克(Zinke，奥地利)首次合成得到，因其结构像一个酒杯而被古奇(C.D.Gutscht，美国)称为杯芳烃•绝大多数的杯芳烃熔点较高，在250℃以上。在常用的有机溶剂中的溶解度很小，几乎不溶于水。杯芳烃具有大小可调节的“空腔”，能够形成主-客复合物，与环糊精、冠醚相比，是一类更具广泛适应性的模拟酶，被称为继冠醚和环糊精之后的第三代主体化合物作为第三代主体超分子化合物，杯芳烃具有独特的空穴结构，与冠醚和环糊精相比具有如下特点：①它是一类合成的低聚物，它的空穴结构大小的调节具有较大的自由度②通过控制不同反应条件及引入适当的取代基，可固定所有需要的构象③杯芳烃的衍生化反应，不仅在杯芳烃下缘的酚羟基、上缘的苯环对位，而且连接苯环单元的亚甲基都能进行各种选择性功能化，这不仅能改善杯芳烃自身水溶性差的不足，而且还可以改善其分子络合能力和模拟酶活力④杯芳烃的热稳定性及化学稳定性好，可溶性虽较差，但通过衍生化后，某些衍生物具有很好的溶解性⑤杯芳烃能与离子和中性分子形成主一客体包结物，这是集冠醚和环糊精两者之长⑥杯芳烃的合成较为简单，可望获得较为廉价的产品，事实上现在已有多种杯芳烃商品化胶束人工酶胶束（micelle）的结构胶束由表面活性物质聚集而成，分子中通常包含亲水基和亲油基两部分•亲水基：带电基团或极性基团•亲油基：含有8个碳原子以上的碳链胶束（micelle）和反胶束（reversemicelle）•胶束/正胶束：在水相中形成的亲油基向内，亲水基向外，在水中稳定分散的表面活性分子聚集体•反胶束：在非极性有机相中形成的，表面活性分子的非极性基团在外与有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核•胶束在水溶液中提供了疏水微环境（胶束内核），类似于酶的结合位点，底物可以结合在此疏水位点上•如果将催化基团（羟基、巯基、氨基、咪唑基等）或一些辅酶共价连接或吸附在胶束上，就有可能提供“活性中心”部位，使胶束成为具有酶活力的模拟酶•X射线晶体衍射表明，胶束的结构与球蛋白类似，胶束对非极性化合物的增溶作用所需的能量与球蛋白也很接近•胶束模拟酶一方面利用增溶、增稳的增效作用，使酶活性呈现“超级活性”。另一方面，利用胶束介质（尤其是反相胶束介质）模拟天然酶在生物体内活体细胞中的微环境胶束酶模型的基本原理分子印迹酶分子印迹技术（molecularimprintingtechnology，MIT）是指制备对某一特定的目标分子具有特异选择性的聚合物的过程，形象地说，就是“锁－钥匙”的识别和制造过程(a)模板(template,T)和功能单体(monomer,M)发生互补识别(b)在印迹分子周围，单体发生聚合反应(c)从聚合物中溶解或分解去除印迹模板(d)模板分子和印迹位点的重新结合，这是(c)的逆过程分子印迹酶什么是“分子印迹酶（molecularimprintingenzyme）”？•通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列•分子印迹酶面临的最大挑战之一是如何利用分子印迹技术来模拟复杂的酶活性中心部位，使其最大限度地与天然酶相似，即选择合适的印迹分子是关键的一环–底物–底物类似物–酶抑制剂–反应过渡态类似物分子印迹酶印迹底物及其类似物•将4(5)-乙烯基咪唑聚合可以得到一种模拟氨基酸酯水解酶的印迹聚合物，可选择性水解与印迹分子结构相关的氨基酸酯底物[N-Boc-氨基酸对硝基苯酯]•由于底物在单体聚合时可能发生水解，因此用其结构类似物[N-Boc-氨基酸-2-吡啶甲酰胺]为印迹分子•聚合后抽提除去模板，在聚合物孔穴内的特定距离位置留下咪唑基（聚合物骨架），能起到催化基团的作用分子印迹酶印迹过渡态类似物•利用分子印迹技术印迹磷酸单酯（充当酯水解过渡态类似物），通过与含脒基（催化部位）的功能单体结合，形成稳定的复合物。此印迹酶表现出很强的酯水解活性•适当地设计模板分子和催化基团，将稳定过渡态和催化基团的准确定位结合起来是提高酶活力的关键NNHHOONNHHOOPOCH3CH3OHOPOOHOCH3CH3OHOOCH3H3CONNHNNHNNHHOONNHHOOCOCH3CH3H分子印迹酶的应用1.色谱分离最广泛的应用之一是利用其特异的识别功能去分离混合物。其适用的印迹分子范围广，无论是小分子(如氨基酸、药品和碳氢化合物等)还是大分子(如蛋白质等)已被应用于各种印迹技术中2.固相萃取通常样品的制备都包括溶剂萃取，由于分子印迹技术的出现，这可以用固相萃取代替，并且可利用分子印迹聚合物选择性富集目标分析物。由于印迹聚合物即可在有机溶剂中使用，又可在水溶液中使用，故与其他萃取过程相比，具有独特的优点。3.天然抗体模拟印迹分子的强度与选择性在一定程度上可以和抗原与抗体之间的作用相媲美，因而可用于抗体模拟,这种模拟抗体制备简单、成本低，在高温、酸碱及有机溶剂中具有较好的稳定性，此外还可以重复使用。分子印记酶的局限性•缺乏酶的柔性，催化效率不高•单体与模板之间形成的次级作用力小，影响聚合物对反应底物的识别能力肽酶模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。1977年Dhar等人报道，人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽具有溶菌酶的活性。其活性为天然溶菌酶的50%西雅图华盛顿大学（UniversityofWashington）的DavidBaker团队DavidBaker所开发的蛋白“全新”设计（DeNovoDesign）采用了一个算法，叫做RosettaMatch。和很多Rosetta的算法一样，RosettaMatch是一个基于“已有知识”的搜素算法。而这里的“已有知识”是已经解析出来的蛋白质结构。反应的酶：设计催化Kempelimination的酶：