血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)

授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。试剂：1.0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。2.ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH（COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNHAR]19.8mg，用10mol/LHC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。4．0.4mol/LNaOH溶液。5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONaAR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制，不得久放。操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）RB血清0.10.1ALP基质液0.5—混匀，置37oC水浴30min2.4-二硝基苯肼0.50.5ALP基质液—0.5混匀，置37oC水浴20min0.4mol/LNaOH5.05.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。血清ALT测定步骤（赖氏法）标准曲线制作：加入物（ml）0123452mmol/L丙酮酸标准液00.050.100.150.200.25ALP基质液0.50.450.400.350.300.250.1molpH7.4磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.10.1混匀，置37oC水浴30min2.4-二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.50.5混匀，置37oC水浴20min0.4mol/LNaOH5.05.05.05.05.05.0相当于ALT单位0285797150200混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，将各管之系光度减去0号管吸光度值后，以吸光度为纵坐标，各管相应的ALT单位为横坐标，绘制标准曲线。结果报告：被检者———————血清ALT——————U——[＜35U]报告者————————————年————月————日临床意义：1．赖氏法的酶活力单位是用卡门法所测出的酶活力单位相当于用本法所生成的丙酮酸量的相关系数套用卡门单位而来，卡门单位的定义：在规定表件下（血清1ml，反应液总量3ml，在25oC下作用1min，用内径1cm的比色杯），测定340nm波长处吸光度减少值（A），每减少0.001为一个酶活力单位。2．血清对照管吸光度基本相同，因此同一批标本只做2～3个血清对照管求其平均即可。亦可以空白管替代对照管。但脂血、溶血和黄疸血清应单独做对照管。3.测定结果超过200卡门单位时，应将血清稀释后在进行测定，结果乘以稀释倍数。4.酶测定中，温度、时间对酶的活力影响很大，故应控制好测定时的温度（要求准确到37±0.5oC），并准确掌握保温时间。5.配制底物液时，如改用改L—型丙氨酸，则应按上法减半量用（因ALT只作用与L-型丙氨酸）。6.丙酮酸钠的纯度，对曲线有明显影响，纯度低曲线斜率就低，使查得的酶活力单位显著增高。故应选择外观洁白、干燥的丙酮酸钠使用。7.丙酮酸的显色受温度影响，故应于季节变化时及底物成份之批号更换时重新制作标准曲线。8．于α-酮戊二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用生成苯腙而显色，为了减少其对丙酮酸测定的干扰作用，底物中α-酮戊二酸的浓度很低，不能保证酶反应的充分进行；且2.4-二硝基苯肼的浓度也比较低，因此标准曲线不呈直线。课后小结：