嗜热性酶的热稳定的分子机制以及热稳定改造的策略

★内部：2年学校代码：10246学号：031023031博士学位论文11家族木聚糖酶的热稳定性与结构特征的关联研究院系（所）：生命科学学院专业：遗传学姓名：游淳博士攻读学位:指导教师：吕红教授完成日期：2009年5月8日博士论文指导小组成员吕红教授复旦大学生命科学学院黄强副教授复旦大学生命科学学院袁汉英副教授复旦大学生命科学学院复旦大学博士学位论文I目录摘要...............................................................1第一部分11家族木聚糖酶热稳定性突变体的筛选与鉴定...............5前言.........................................................5材料和方法...................................................7结果.......................................................241、11家族木聚糖酶的氨基酸序列和三维结构..............242、筛选热稳定性增强的木聚糖酶突变体...................263、点突变G201C提高了木聚糖酶的热稳定性...............284、G201C突变体中没有引入一对新二硫键.................305、蛋白质表面半胱氨酸对木聚糖酶热稳定性的影响.........356、201位氨基酸的疏水性对木聚糖酶热稳定性的影响.......377、50位和201位之间的疏水结合对木聚糖酶热稳定性的影响398、圆二色光谱分析木聚糖酶的热稳定性...................429、木聚糖酶突变体热稳定性提高的结构基础...............4810、野生型木聚糖酶和突变体活性的测定..................5111、非保守区域氨基酸的定点突变对木聚糖酶热稳定性的影响58讨论........................................................61小结........................................................68参考文献....................................................69第二部分底物对木聚糖酶的热稳定作用............................74前言........................................................74材料和方法..................................................75结果........................................................761、木聚糖酶和D57N突变体的活性测定....................762、木聚糖酶和D57N突变体动力学常数的测定..............793、木聚糖酶和D57N突变体热稳定性的测定................834、11家族木聚糖酶与底物的结合位点的结构分析..........87讨论........................................................96小结.......................................................100参考文献...................................................101综述嗜热性酶的热稳定的分子机制以及热稳定改造的策略..............105参考文献...................................................113博士期间发表论文以及专利.........................................118复旦大学博士学位论文II获奖情况.........................................................118致谢..........................................................119复旦大学博士学位论文1摘要蛋白质的三维结构决定其功能，二硫键，离子对，疏水作用等结构因素都会影响蛋白质的热稳定性。大量的晶体结构研究表明，嗜温性和嗜热性的蛋白质内部疏水区域的序列和结构很保守，这表明嗜温性的蛋白质内部疏水核心的氨基酸同样堆积得非常有效，以保证其结构的稳定及功能的行使。在蛋白质内部疏水区域的点突变常常会破坏这种堆积效果，从而导致蛋白质热稳定的降低。因此目前对于蛋白质热稳定性提高的点突变大多数都是发生在蛋白质的表面。本论文第一次报道了在蛋白质内部疏水区域的两个半胱氨酸之间的疏水结合提高了蛋白质的热稳定性。本论文通过定向进化和定点突变鉴定了来源于Neocallimastixpatriciarum的木聚糖酶C（XynC）内部疏水核心的一个点突变（G201C），该点突变导致该突变体的热稳定性明显提高，同时酶的比活也显著提高。在该突变体中，201位和50位的半胱氨酸所形成的疏水结合是导致热稳定性提高的主要原因。突变体的SDS-PAGE和自由巯基的测定均表明50，201位的半胱氨酸之间并不形成二硫键。这表明半胱氨酸不但可以通过形成二硫键，还能通过其本身的强疏水性质提高蛋白质的稳定性。在50和201位点上为半胱氨酸的G201C和C60A-G201C两个突变体比本研究中其余的木聚糖酶突变体的热稳定性都要高。通过圆二色光谱分析，G201C的Tm值比野生型提高了9度，C60A-G201C提高了12度。经过酶活测定，G201C和C60A-G201C在所有的温度和pH值所测定的比活都要比野生型高，在72度，C60A-G201C的酶活是野生型的6倍。这表示C60A-G201C突变体酶在工业应用中具有比野生型更加广阔的应用前景。该实验结果提示我们可以通过改变蛋白质内部氨基酸的疏水性从而改变蛋白质的热稳定性，为后来的蛋白质理性设计提供新的思路和方向。另一方面，一些外界因素同样有可能导致酶的热稳定性发生变化，在这些外界因素中，底物一直被认为能够通过稳定酶的活性中心而使酶在高温下稳定。虽然底物对酶的热稳定作用是被报道得较多的，但通过点突变提高底物对蛋白质的热稳定作用却很少被报道。本研究中，我们将XynC活性中心的57位的Asp突变为Asn。在底物不存在的情况下，XynC和D57N突变体的热稳定性是相同的；但是在底物存在的情况下，底物却能更好的稳定D57N突变体，使其表现出比野生型更高的热稳定性。突变体中的Asn57，Glu202与底物分子之间可能存在的氢键导致底物能更好的稳定突变体。该结果表明，酶在底物存在时的热稳定性同样可以改造的，这就为以后通过定向进化或理论设计提高工业用酶的热稳定性指出了另一种方向：通过增强底物对酶的稳定作用而使酶的热稳定性提高。这种突变体的获得一方面可以满足于工业生产的需要，另一方面为了解底物和酶的结合机制提供了理论模型。复旦大学博士学位论文2关键词:木聚糖酶，热稳定性，底物，半胱氨酸，疏水作用，二硫键。中图分类号：Q556+.2复旦大学博士学位论文3AbstractTheproteinstructuredetermintesitsfunction.Somestructuralbasislikedisulfidebond,ionpairs,hydrophobiceffectmayaffecttheproteinthermostability.Astheproteininteriorhydrophobicregionofthermostableproteinsandmesostablehomologuesarebothpackedalmostasefficientlyaspossible,mutationintheproteininteriorhydrophobicregionareoftendestabilizing,mostcurrentstabilizationstrategiesaredirectedontheproteinsurface.Inthepresentedresearches,byusingdirectedevolutionincombinationwithsite-directedmutagenesis,weidentifiedapoint-mutationG201Ctakenplaceinproteininteriorhydrophobicregioninafamily11xylanase(XynC)fromNeocallimastixpatriciarum.G201CishydrophobicallyassociatedwithC50ratherthantheformationofanewdisulfidebondbetweenC50andC201.RosettaDesignandpointmutationusingresidueswithdifferenthydrophobicnaturedemonstratethatthethermostabilityofthevariantiscorrelationwithhydrophobicityoftheresiduesinsite50and201.Twomutants,G201CandC60A-G201C,wereidentifiedgreatlyincreasedthermostabilitythanthewild-type.Bothinsite50and201ofthesetwomutantsarecys,whichisconsideredasthemosthydrophobicityresidue.Thefar-ultravioletcirculardichroismsignalshowedthatthetransitiontemperature(Tm)ofthemutantG201Cisabout9oChigherthanthatofthewild-type,whiletheC60A-G201Cabout12oChigher.Thispaperfirstfoundahydrophobicinteractionbetweentwocysteines,thisinteractionstabilizestheproteinbydecreasingtheentropyoftheunfoldedstate.Accompaniedwiththeincreasedthermostability,thesetwomutantsalsopossesshigherspecialactivitythantheirparentatalltestedpHsandtemperatures.Thissuggeststhatcysteinecouldstabilizetheproteinnotonlybytheformationofdisulfidebond,butalsoforitsstronghydrophobicityintheproteininteriorhydrophobicregion.Theobtainedmutantswithhigherthermostabilityandspecialactivityareimpliedtheirpotentialapplicationsinindustrialprocesses.Ourresultssuggestthatwecouldimprovetheproteinthermostabilitythr