TRITC Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽说明书

北京索莱宝科技有限公司第1页，共3页TRITCPhalloidin罗丹明标记鬼笔环肽说明书货号:CA1610规格:300T（300μL）保存:-20℃避光干燥保存，1年有效。产品说明:鬼笔环肽（Phalloidin）是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanitaphalloides）的环状七肽毒素，以高亲和力（Kd=20nM）选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白（Actin）抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量＜2000Daltons，未标记肌动蛋白（Actin）的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNaseI等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。产品性质:分子式（MolecularFormula）C60H70N12O13S2分子量（MolecularWeight）1231.4最大激发/发射波长（Ex/Em）540~546/565~575nm多肽序列（Sequence）TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3to6)外观（Appearance）紫色液体需要自备材料:1.（可选）甲醇北京索莱宝科技有限公司第2页，共3页2.1×PBS缓冲液,pH7.4,细胞培养级别3.固定液4%多聚甲醛（溶于PBS缓冲液）4.丙酮或透化液0.5%TritonX-100（溶于PBS缓冲液）5.Fluoromount-GTM水溶性封片剂（不含DAPI），DAPI6.（可选）DAPIFluoromount-GTM水溶性封片剂（含DAPI）7.（可选）BSA，标准级别8.载玻片和盖玻片9.盖玻片周围密封液（如透明指甲油）10.组装有TRITC激发/发射滤片，以及DAPI激发/发射滤片的荧光显微镜或共聚焦显微镜。操作步骤:1.工作液准备本品以溶于甲醇的20µM储存液形式提供，总量为300µl。按照100nM的工作液浓度来换算，可制备总量为60ml的工作液。建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。开始实验前，使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200nM。现配现用。2.染色步骤1）细胞爬片生长24h，使其密度达到50%汇合度。2）吸掉培养液，37℃预热的1×PBS（pH7.4）清洗细胞2次。3）使用溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定10min。注意：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。4）室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。5）室温条件下，用丙酮（≤-20℃）脱水或者用0.5%TritonX-100溶液透化处理5min。6）室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。北京索莱宝科技有限公司第3页，共3页7）取200µl配制好的TRITC标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min（通常情况下，4℃~37℃孵育皆可）。注意：为了降低背景，可于TRITC标记的鬼笔环肽工作液内加入1%BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可将盖玻片转移到一个密封的容器内。8）用PBS清洗盖玻片3次，每次5min。9）使用200µlDAPI溶液（浓度：100nM）对细胞核进行复染，约30s。10)用PBS清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-GTM水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油永久封片。此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做F-actin染色分析。注意：也可以直接使用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂合并步骤9）10），简化步骤。11)荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择TRITC激发/发射滤片（Ex/Em=540/570nm）和DAPI激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）。