日本血吸虫DNA疫苗的优化策略

1日本血吸虫DNA疫苗的优化策略李春艳，余龙江*，鲁明波，朱路,夏涛华中科技大学生命科学与技术学院，武汉，430074摘要：血吸虫病严重危害着人类及家畜健康，发展疫苗是防治血吸虫感染的有效措施。传统疫苗的发展因成本高、免疫原性低以及安全隐患而受到限制。因此，DNA疫苗成为近年的研究重点。为提高DNA疫苗的免疫保护力，候选抗原的筛选、质粒载体的优化、基因佐剂的选用、多价疫苗的构建、不同种疫苗的交叉免疫、改善免疫方式和免疫途径等被认为是日本血吸虫DNA疫苗的优化策略。关键词：日本血吸虫；DNA疫苗；优化血吸虫病是以虫卵肉芽肿和肝纤维化为主要病理特征的人畜共患寄生虫病。据WHO估计全球至少有6亿人受到感染血吸虫病的威胁，约2亿人受到感染。我国是日本血吸虫病4个流行国（中国、菲律宾、印尼、日本）中最严重的国家之一，主要流行于长江流域及以南的12个省、市、自治区和直辖市，累计感染者达1160万人，钉螺面积为143亿m2，受威胁人群在1亿以上。目前，我国防治血吸虫病的主要措施是杀灭钉螺和药物化疗。但是，由于血吸虫保虫宿主繁多，钉螺分布广，吡喹酮化疗对已形成的虫卵肉芽肿没有作用，再感染频繁发生，以及可能产生的血吸虫虫株抗药性，使血吸虫病的流行状况仍未得到根本改善。因此，发展疫苗被认为是防治血吸虫感染急需的措施。传统的血吸虫疫苗有减毒活疫苗、死疫苗和基因工程疫苗。减毒活疫苗可刺激机体产生CTL、Th及增强体液免疫等多种保护性反应,但是存在毒力回复的潜在危险和虫源限制。死疫苗比较安全,但是免疫原性较低。而基因工程疫苗制备中的基因克隆、表达和蛋白纯化等过程复杂，技术难度大,成本较高。这些限制了传统疫苗的发展，使DNA疫苗成为近年的研究重点。DNA疫苗是将编码目的抗原基因的重组表达载体经各种转移途径转入机体细胞,借用宿主细胞的表达加工合成抗原分子,从而诱导机体免疫应答，其操作简单，能同时诱导体液免疫、Th1细胞和CTL应答，且易于组建多价疫苗，克服了传统疫苗的诸多不足。但是多年的研究仍然难以解决血吸虫DNA疫苗免疫力有限的现实问题。这主要与血吸虫是一种多细胞生物，抗原成分复杂，在长期与宿主共同进化的过程中产生了多种免疫逃避机制等因素有作者单位：华中科技大学生命科学与技术学院，武汉，430074*通讯作者：余龙江，Tel:[phone];E-mail:[e-mail]关。鉴于此，诸多学者着力于从候选抗原分子的筛选、佐剂的选择、免疫途径和方式、多价疫苗的构建等来研究如何增强血吸虫DNA疫苗的免疫力。现就本课题组的研究结合中外学者的经验提出构建日本血吸虫DNA疫苗的优化策略。1血吸虫候选抗原的筛选抗原是诱发机体免疫应答的物质基础和先决条件。一种物质能否成为抗原由其本身的结构特点与其发生应答的机体两方面因素决定的。由于血吸虫是多细胞生物，生活史复杂，不同的发育阶段处于不同的环境条件下，因此其生理、生化和相应的结构也随虫期的变化而不停地调整，不同虫期的新陈代谢产物也都随之变化，其中有些代谢产物在不同虫期中普遍存在，但有些代谢产物却具有种、株甚至虫期的特异性。这些特点决定了血吸虫抗原种类较多。80年代以来，人们开始研究日本血吸虫特定抗原分子及其编码基因的克隆和表达,一批能诱导宿主产生保护性免疫的候选抗原受到关注。WHO／TDR提出的血吸虫疫苗候选分子有:谷胱甘肽-S-转移酶(GST),副肌球蛋白(Paramyosin),照射减毒抗原5(IrV-5),磷酸丙糖异构酶(TPI),完整膜蛋白23KDa,脂肪酸结合蛋白(FABP)，相关研究见表1【1－3】。其中，FABP是一族多源性的小分子胞内蛋白质，属于脂结合蛋白家族，能够结合饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和脂肪酸。由于血吸虫缺乏合成长链脂肪酸及胆固醇的途径，必须利用细胞膜和质膜中的FABP来结合和转运宿主血液中的脂肪酸，以合成磷脂和脂肪，进而实现血吸虫多种生物功能，如膜的形成等。因此作为一种疫苗候选分子及抗血吸虫病药物作用的主要靶标，已处于临床前工业放大试制阶段表1：不同候选抗原在不同模式动物中的免疫效果抗原宿主免疫效果SjGSTSheep减虫率65%,肝组织减卵率70.5%Pig肝组织减卵率53.5%Waterbuffalo减卵率50%Cattle减虫率30%,肝组织减卵率60%SjParamyosinMouse减虫率32%,肝组织减卵率34-66%Mouse减虫率35.5-41.1%,肝组织减卵率44.5-59.6%脾减卵率56.7-82.4%,肠组织减卵率57.9%Mouse减虫率17.8%,肝组织减卵率16.9%Pig减虫率32.9-34.5%,肝组织减卵率未见减少Waterbuffalo肝组织减卵率42-48.8%SjTPIMouse减虫率30.2-32.7%,减卵率52.9%Pig减虫率48.3%,减雌率53.6%,肝组织减卵率49.4%粪卵减少率23.6–63.3%肝减卵率44.9%,肠组织减卵率69.6%Mouse减虫率24.1%,肝组织减卵率27.2%Sj23Pig减雌率50.8%,减卵率48.2%Rat减虫率26.9%,肝组织减卵率22.2%Waterbuffalo减虫率38%,肝组织减卵率50%Waterbuffalo减虫率39%Mouse减虫率45.5%,肝组织减卵率58.4%根据血吸虫抗原分子的体内分布、生理功能、诱导的保护水平、效应机制不同,国内外学者又寻找到了Sj31B1N（组织蛋白酶B）、SjGCP（抱雌沟蛋白Gynecophoralcanalprotein）、SjCalpain等其他候选抗原分子并已取得可喜的进展。用日本血吸虫Sj31B1N免疫小鼠，发现成虫的发育受到影响，肝组织减卵率为59.3%～69.0%，肠组织减卵率为57.6％～62.1％，粪卵减少率为86.5％，增加攻击感染尾蚴条数(50条)，仍然能取得显著的免疫保护效果【4】。将编码SjGCP基因保守区cDNA片段克隆到真核表达载体中，以重组质粒直接免疫昆明系小鼠。免疫鼠血清中出现抗rGCP的抗体，尾蚴攻击感染后减虫率为32.4％，肝组织减卵率为46.9％，显示GCP核酸疫苗具有一定的抗生殖免疫保护作用【5】。将重组的SjCalpain加福氏完全佐剂免疫BALB/c小鼠获得41.2%的减虫率,每雌产卵数明显减少（6057vs3762），免疫鼠的肝脏肉芽肿病变也明显减轻【6】。可见，Sj31B1N，SjGCP，SjCalpain均为潜在的有效日本血吸虫候选抗原分子。除此之外，SjGAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、SjCalreticulin(钙网蛋白)等日本血吸虫分子也进入了研究者的视线。2抗原分子的优化组合血吸虫是一种生活史复杂的多细胞真核生物，虫期不同特异性抗原不一样，宿主感染血吸虫后的免疫保护机制复杂多样,应用筛选出的保护性抗原分子制成的单价疫苗不可能产生完全的保护力。现已证明选择不同抗原表位组成的多价、混合疫苗，能协同诱导不同的免疫杀虫机制,杀灭多个发育期的血吸虫，增强机体对血吸虫免疫保护力。2．1不同抗原DNA疫苗的混合免疫李柳哲将单价DNA疫苗pBK－CMV－Sj26和pBK－CMV－Sj23混合后免疫小鼠，发现混合疫苗的免疫效果优于单价疫苗。之后，ShiF等【1】将Sj28GST的重组质粒和Sj23重组质粒按一定比例混和配方免疫羊和牛；朱荫昌等【7】将日本血吸虫SjCTPI和SjC23DNA疫苗混合免疫小鼠，均获得效价优于单价疫苗的免疫保护力。Zhang等【8】将编码有Sj62，Sj28，Sj23和Sj41-3-3等四种不同日本血吸虫抗原的质粒混合成的DNA鸡尾酒疫苗肌肉注射免疫小鼠3次后，产生高水平的IFN-γ,诱导典型的Th1型细胞免疫,同时产生特异性的IgG,其保护力达44%～45%。2.2由不同的抗原分子构建多价DNA疫苗张冉等研究了日本血吸虫大陆株二价DNA疫苗VR1012-SjGST-Sj31和VR1012-SjGST-Sj32，发现这两种DNA二价疫苗均能在组织中正常表达,且能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,而且二价疫苗的抗生殖免疫效果大于单价疫苗【9】。李柳哲等将构建的日本血吸虫多价DNA疫苗pBK-CMV-Sj26-Sj23和pBK-CMV-Sj32-Sj23免疫小鼠能产生特异性免疫应答，其诱导小鼠对抗血吸虫侵袭感染的减虫率为28.12％和28.50％，两者与单价DNA疫苗组比较似有所提高；但两者所诱导产生的减卵率并无明显提高，其原因也许与多价疫苗经过多肽连接后，有可能影响肽链的折叠，从而影响抗原被免疫细胞所识别有关。为避免上述问题，更好地发挥多价疫苗中单个抗原分子的作用，李春艳等采用重组PCR技术构建融合表达的DNA多价疫苗pVIVO2SjFABP-23。该组采用含有l5个氨基酸的疏水性多肽接头DNA序列即(Gly4Ser)3，将SjFABP和Sj23两个抗原分子进行拼接。由于该多肽序列活动度较好，具有良好的柔韧性和折叠性，长短合适，将它放入2个抗原分子之间，不影响两个抗原分子的天然三维结构，可以充分发挥两个抗原成分的作用。因此免疫小鼠后获得52.14%的减虫率和60.93%的减卵率，具有比单价疫苗更好的免疫保护作用【10】。3DNA疫苗质粒载体的优化3.1优化质粒构建DNA疫苗的载体及其组件直接影响外源蛋白的表达量和机体的免疫反应状况。用于DNA疫苗的真核表达载体多以pBR322或pUC质粒为基本骨架，具有增强子一启动子（一般CMV巨细胞病毒启动子的调节功能最好）、选择标记、翻译起始序列、转录终止序列和PolyA尾等元件；它们带有细菌复制子，能在大肠杆菌内高效稳定地复制，但不能在哺乳动物细胞内复制；它们不应整合到宿主动物的染色体中，也不能诱导抗质粒载体的免疫应答。美国FDA规定,应用于人体的质粒DNA疫苗不应含有氨基甙类抗生素，推荐使用含卡那霉素和新霉素等抗性基因的表达载体。为此，李柳哲等将日本血吸虫同一抗原分子分别插入含有氨苄青霉素抗性基因的pcDNA载体和含有卡那霉素的真核表达载体pBK，比较含日本血吸虫同一抗原分子的不同真核表达载体诱导小鼠的抗攻击感染能力，却发现疫苗pCD－Sj23和pCD－Sj26诱导小鼠的减虫率分别为30.50%和33.02%，疫苗pBK－Sj23和pBK－Sj26诱导小鼠的减虫率分别为18.24%和21.70%,说明由真核表达载体pCD构建的DNA疫苗比由pBK构建的DNA疫苗具有更好的抗血吸虫感染的能力。原因可能是氨苄西林抗性选择基因中包含有回文结构：5'-AACGTT-3'。该结构被证明能诱导单核细胞产生IL-12，刺激细胞分泌干扰素，增强NK细胞的活性。但是，出于生物安全性的考虑，设法去掉质粒载体上的抗性基因也许是更为理想的选择，不过尚需更进深入的研究。3.2优化CpG序列CpG序列是以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基元构成的特定结构。载体中的CpG序列和单独的CpG寡核苷酸序列一样,都可作为佐剂刺激机体产生免疫应答,增强免疫效果。Krieg首次报道了含有CpG的DNA具有促进多种免疫细胞活化，诱导多种细胞因子产生等作用。赵松等【11】通过研究CpG免疫刺激序列对日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶DNA疫苗诱导BALB/c小鼠免疫保护的增强作用，发现pcDNA3.1-TPI组和pcDNA3.1-TPI/CpG组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体，抗体亚类IgG2a/IgG1的比值分别为1.76和2.67，后者的减虫率（34.54%）高于前者（25.98%）。该研究组还将SjC23基因片段克隆到增加了免疫刺激序列的真核表达质粒pcDNA3.1-CpG中，构建载体pcDNA3.1-SjC23／CpG，免疫小鼠发现pcDNA3.1-SjC23／CpG组