真核表达系统的选择和高效表达策略

微生物基因工程李刚副教授教学内容•一、PCR引物的设计与实验操作技巧；二、基因组文库的建立与筛选；三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中•的应用；四、原核表达系统的选择和高效表达策略；•五、真核表达系统的选择和高效表达策略。五、真核表达系统的选择和高效表达策略真核生物表达系统主要包括：酵母表达系统、杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统、转基因植物表达系统、杜氏盐藻生物反应器等五种表达系统。其中应用最广泛的是酵母表达系统。真核表达系统的优点•真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。酵母表达系统•主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统，也是目前应用最广泛的酵母表达系统。主要有H.polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三种,其中PichiaPastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛。由于它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的真核表达系统之一。酵母表达系统的优点•①酵母长期广泛应用于酿酒和食品工业,不会产生毒素,安全可靠;②酵母是真核生物,能进行一些表达产物的加工,有利于保持生物产品的活性和稳定性;③外源基因在酵母中能分泌表达,表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化,而且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响;④遗传背景清楚,容易进行遗传操作;⑤较为完善的表达控制系统,如PMA1和PDR5等强启动子可以介导目的蛋白高水平表达,表达蛋白的丰度可以达到膜蛋白的10%;酵母表达系统的优点•此外,采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制目的蛋白的表达,如GAL1-10(半乳糖诱导)、PH05(胞外无机磷诱导)和HSE(37℃温度诱导);⑥生长繁殖迅速,培养周期短,工艺简单,生产成本低。•酵母菌用于真核基因的表达、分析,既具有原核表达系统生长迅速、操作简单、价格便宜等优点,又具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程,因而特别适用于大量生产真核重组蛋白,正是由于有这些优点,使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能基因组研究的前列,是应用最为普遍的真核表达系统之一。杆状病毒表达系统•昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%;可表达非常大的外源性基因(～200kD);具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。哺乳动物细胞表达系统•与其他的真核表达体系相比,哺乳动物细胞表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白,但成本较高。近年来,研究者们主要通过改造宿主细胞和基因导入方法来提高外源蛋白的表达效率。哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等。将外源基因导入哺乳动物细胞内的方法,主要有化学法、电穿孔法、基因枪法和哺乳动物病毒载体系统等。转基因植物表达系统•转基因植物是指利用一定的手段将外源性或内源性的基因导入到植物体内,使植物的遗传性状改变而产生的植物体。转基因植物作为生物反应器已在药物蛋白的生产中被广泛使用,成功表达的药用蛋白质和多肽有:人的细胞因子、表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体等.烟草、马铃薯、大豆、香蕉、莴苣、羽扇豆等作为生物反应器生产口服疫苗,也得到了人们的广泛关注。转基因植物疫苗和药用蛋白的表达系统主要有农杆菌介导的核转化系统、植物病毒瞬时高效表达载体和植物叶绿体高效表达系统。在研究成功的转基因植物药用蛋白中,80%是由农杆菌介导形成的转基因植物表达系统生产。•在重组药物的多种表达体系中,转基因植物是最经济的。同一种重组蛋白在植物中的生产成本是微生物发酵体系的2%-10%,是哺乳动物细胞生产的0.1%。杜氏盐藻生物反应器•杜氏盐藻是一种单细胞真核藻类,没有细胞壁，原生质外仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜，具有一个杯状、大型的叶绿体,体积约占细胞的一半。盐藻是极其耐盐的，可以在0.05-5mol/l氯化钠的极端环境中生存。盐藻属于光和自养生物,能利用简单的培养基进行培养，富含β胡萝卜素、甘油、蛋白质等。盐藻作为新型的真核生物反应器，除了具有转录和翻译后的加工能力外，还具有经济廉价、简单有效、安全可靠等特点。由于它能在高盐条件下培养，所以不会污染其他的微生物，这点是哺乳动物细胞所不及的。外源基因在盐藻中的表达主要是集中在cat、bar、gus和egfp等报告基因上,大多为瞬时表达。目前,只有乙肝表面抗原(HbsAg)和筛选标记bar基因能够在盐藻中稳定表达。盐藻作为一种新型的生物反应器,目前还不能真正生产外源性物质。研究者们正从强启动子的筛选、高效转化载体的构建、最佳转化方法的确立等几方面努力，目前已经取得了一定的成果。巴斯德毕赤酵母表达系统•毕赤酵母能够成功表达出多种外源蛋白,是由于毕赤酵母具有以下独特的优点:•(1)能够快速繁殖和进行高密度培养;•(2)具有强启动子-乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,并且能•够严格调控外源基因的表达;•(3)可以对外源蛋白进行类似真核的加工折叠和翻译后修•饰,产物从而具有天然蛋白的活性;•(4)表达产量高,杂蛋白少,并且能够胞外分泌表达,容易分•离提纯;•(5)培养条件简单,成本低。•毕赤酵母与最早研究的酿酒酵母相比,能够高密度培养,容易实现工业化,并且不存在酿酒酵母的过度糖基化问题,也不易产生免疫原性问题。巴斯德毕赤酵母表达系统•巴斯德毕赤酵母菌株：•一般用于外源基因表达的Pichiapastoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,X-33，KM71,SMD1168等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为3型:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为Mut+表型。②Muts型,此型毕赤酵母菌(如KM71)细胞AOX2基因编码的醇氧化酶可产生15%AOX活性,为甲醇慢利用型。③Mut-型(如M2G10023),此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用型。研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163,SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解。一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用。甲醇慢利用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量。Pichiapastoris表达载体•毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载体，但以整合型载体为主。常见的整合载体又分为胞内表达和分泌表达2类。胞内表达的载体有pPIC3、pPIC3K、pPIC3.5K、pHILD2、pPICZA、pPICZAB和pPICZAC等；分泌表达的载体有pPIC9、pPIC9K、pACO815、pPICZαA（B、C）和pHILS1等。通用的整合载体多含有AOX1启动子，有一个外源基因表达框、多克隆位点（MCS）和一个从AOX1基因上拷贝下来的终止序列（TT），作为筛选标记的his4基因和在细菌中进行复制起始点和选择标记（如ColE1复制起始点和抗氨苄青霉素基因）以及AOX13’端的非编码区序列，使外源基因能以同源重组的方式整合到染色体的AOX1部位。巴斯德毕赤酵母表达载体的结构与功能毕赤酵母表达载体的启动子•Pichiapastoris含有两个基因编码醇氧化酶:AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表达水平高于AOX2。AOX1启动子的表达受甲醇严格调控。以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA由AOX1基因转录。PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,GAP启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单.。Vassilen利用GAP启动子表达乙肝表面抗原获•得高表达,Genzyme也利用GAP启动子表达人几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解。此外，Phongdara在Hansenulapolymorpha克隆到酸性磷酸酶(pHO1)基因启动子，这些启动子丰富了甲醇酵母对启动子的选择。毕赤酵母表达载体上的选择标记•选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因,常用his4,也可用来源于酿酒酵母的arg4基因和suc2基因.kanr基因和Shbler基因（Zeocin抗性基因）也能够作为细菌和酵母菌的选择标记，并且携带这两个标记的表达载体较其他表达载体更易于筛选。信号肽序列•可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的信号肽和酵母本身的信号肽.有些蛋白的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可试用甲醇酵母信号肽。目前可供选择的酵母信号肽有2交配因子的前导肽序列、酸性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等。其中酿酒酵母2交配因子前导肽序列的使用最为广泛。酶切割位点周围氨基酸序列及外源蛋白的3级结构可以影响信号肽的加工效率。毕赤酵母表达载体的种类•Invitrogen公司开发出了若干系列的表达载体可供选择。当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可分为2类.①胞内表达载体。如pHIL2D2,pAO815,pPIC3K,PICZ,pHWO10,•pGAPZ.②分泌表达载体。如pHIL2S1,pPIC9K,pPICZα,pGAPZα。•目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基因表达产物的分泌,常用α2因子信号肽。许多蛋白的正确构象和翻译后加工(如糖基化等)都是在分泌途中完成的。外源基因的转化及整合•将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中诱导表达，其常用的转化方法是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合.Zeocin抑制细胞壁的形成,因此pPICZ系列不能使用原生质体法进行转化。转化时,载体DNA必须切成线状才能与染色体进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入宿主染色体.通常有以下几种整合方式:①双位点互换。发生在染色体AOX1位点和表达质粒中的PAOX1及转录终止区,产生的表达菌的表型为His+Mut-。②AOX1单位点互换。发生在染色体和表达质粒的AOX1区。产生的表型是His+Mut+。③His单位点置换。发生在染色体His位点和表达质粒的His位点,使得1个或多个表达单位插入在His位点,产生的表型也是His+Mut+。巴斯德毕赤酵母载体在宿主染色体上大多为单拷贝整合,由于PAOX1的强启动性和整合后的稳定性,所以单拷贝也能获得较高的产量。重组蛋白翻译后修饰•Pichiapastoris能进行与高等真核细胞相似的许多翻译后修饰,包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、O-连接和N-连接糖基化等。巴斯德毕赤酵母对分泌的外源蛋白的糖基化已成为研究的热点。巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有2个主要特征:①极少出现过度糖基化。一般情况下毕赤酵母能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链,且较均一,长度在8～14个之间,使产物更加稳定。②糖链中不含具有潜在致敏作用的-1,3-甘露糖。影响外源基因表达的因素•影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素主要包括:外源基因自身的特性、外源基因整合的拷贝数、外源基因在染色体上的整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、分泌信号、产物稳定性、翻译后修饰以及培养条件等。外源基因自身的特性•外源基因的特性是决定表达成败的首要因素。特定的（A+T）富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号，导致仅产生低水平或截短的mRNA。某些稀有密码子，尤其是稀有密码子密集区往往成为制约翻译速率的因素。在某些情况下，可通过定点突变去除成熟前终止结构域和替换稀有密码子。但在更极端的情况下，即基因中