10组织培养第十章常见植物脱毒与快繁

第十章常见植物脱毒与快繁技术宜职院08.9目的与要求了解农作物、果树、花卉、药用植物的脱毒和快繁的生产意义与基本技术，根据地方特点和组培技术现状，例举部分植物进行讲授，并结合学生查阅资料共同探讨。具有农作物、果树、花卉、药用植物快繁基本技术，具备马铃薯、草莓等植脱毒技术，进行微型薯生产基本知能，有利用图书及网络资源收集相关资料，了解相关行业信息的能力，并具备一定交流探讨能力。第一节农作物的脱毒与快繁植物组织培养技术已广泛运用于农作物育种和良种繁育，尤其是许多无性繁殖类农作物脱毒及良种快繁，对提高农作物生产的产量和品质发挥了极其重要的作用。一、马铃薯的脱毒和快繁（一）茎尖培养脱毒1、取材生产大田顶芽，或块茎，预培养抽生的枝条污染较少。供试材料存在病毒可结合热处理脱毒。2、消毒自来水冲洗1h，70%酒精30s，10%漂白粉溶液5～10min，无菌水冲洗2～3次。3、接种解剖镜下，解剖刀切取0.1～0.3mm带有1～2个叶原基的茎尖，接种到培养基上。4、培养条件MS、Miller，25±2℃，1000lx，4周后增至2000～3000lx，光照16h。5、病毒鉴定目测法和指示植物鉴定法。（二）微型薯生产技术由试管苗生产的重1～30g的微小马铃薯被称为微型薯。不带病毒，增产效果一般在40%以上。1、试管生产微型薯一般只有1～5g。用组织培养方法生产微型薯分以下两个步骤：（1）单茎段扩大繁殖（2）微型薯的诱导。2、温室多层架盘工厂化生产3、低网畦生产二、甘薯的脱毒与快繁（一）茎尖培养1、茎尖培养脱毒取高产、优质母株枝条，切成带1芽小段。自来水流水冲洗，70%酒精10s，0.1%的升汞10min，无菌水4～5次，或2%次氯酸钠5min，无菌水3～4次。2、茎尖剥离和培养解剖镜下剥去芽上较大幼叶，切取0.3～0.5mm含1～2个叶原基的茎尖分生组织，迅速接种到制备好的培养基上。3、病毒检测目测法和指示植物鉴定法。（二）脱毒苗扩繁和种薯的生产通过病毒检测的脱毒苗先在试管内进行切段快繁。30d左右长成有6～8片展开叶的试管苗。待试管苗繁殖到一定数量后，即可在防虫条件下于无菌基质中进行栽培繁殖。所结小薯即为原原种薯。以原原种（苗）为种植材料，在防虫条件下的无病毒土壤上培育出的薯块即为原种。以原种苗在大田条件下生产所结薯块即为生产用种薯（良种）。红薯原原种炼苗第二节果树脱毒快繁利用组织培养方法繁殖果树植株具有占地面积小，繁殖周期短，全年都能进行繁殖，繁殖系数高等特点。还可以消除果树的某些病毒病，适应果树向品种更新快、矮化密植以及无病毒栽培方向发展的需要。一、草莓（一）草莓离体快繁技术1、外植体6～7月份匍匐茎15～20cm长时取材。2、培养基初代MS+6-BA0.5mg/L+GA30.1mg/L+IBA0.2mg/L增殖MS+6-BA0.5～1.0mg/L。3、生根和驯化1/2MS+IBA0.2～1.0mg/L根2～3cm时炼苗，一周后发新根，四周后可移栽。（二）花药培养脱毒1、花药培养脱毒技术春季取单核期花蕾（直径约4mm），4～5℃低温处理24h。浸入70%酒精30s，漂白粉或0.1%氯化汞10～15min。剥取花药放在培养基上。诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+IBA0.2mg/L，继代培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L2、脱毒苗的检测指示植物小叶嫁接鉴定法和电子显微镜鉴定法。草莓小叶嫁接法二、柑橘1、茎尖微芽嫁接砧木种子45℃温水浸泡5min—55～56℃热水处理50min—取出吸干—消毒—剥去种皮—种子接种于MS培养基—27±1℃暗培养—2周后萌发芽苗可作砧木。接穗材料强健新梢—热空气处理45min(50℃)—取lcm长芽条—消毒处理—切取0.14～0.18mm微茎尖。砧木苗切去长根和子叶，上胚轴留1～1.5cm切除顶部，垂直于茎，切开一个倒T字形切口，将微茎尖放置于砧木切口内，茎尖底部和砧木切口形成层紧密贴合。嫁接苗转植于新鲜培养基上，27±1℃、16h光照，2～4周后抽生新芽，成活率可达20%～50%。5～8周可移植。柑橘花药培养示意图2、无病毒苗的繁殖经无病毒苗鉴定后选出无病毒良种苗木，可建立原种母本园。在隔离区，按无病苗的栽培要求建成无病良种母本园，供繁殖无病苗木采穗用。三、香蕉（一）花序轴切片培养1、花序轴切片香蕉果穗已完全抽出时采上部末结实花序，无菌下剥取苞片除去子房。取顶端10～15cm长的花序轴段，灭菌后横切成2～3cm厚的薄片，再纵切成数片。2、培养过程常用MS培养基，也可用SM或改良MS，继代也可用Knudson培养基。香蕉雄花序外植体诱幼苗过程（二）影响试管育苗的关键技术芽的反复增殖是香蕉试管育苗的技术关键。芽的增殖效果如何，较重要的衡量指标是增殖率和代期（—次继代培养的时间），均与生长调节剂关系最为密切。细胞分裂素以6-BA3～4mg／L为宜，增殖率可达到4以上，代期为3～4周，因而增殖效率高。第三节蔬菜组织培养一、番茄1、花药培养⑴取花药3～7mm长、单核中期的花蕾。⑵将花蕾用0.1‰吐温40溶液浸泡5min—70％酒精15s—3％的漂白粉10min—无菌水冲洗—接种⑶从花蕾中取出花药，接种在DBMII＋2.0mg/LNAA＋1.0mg/LKIN的培养基上，27℃、24h光照后黑暗下培养。2、叶培养⑴取无菌幼嫩叶片，切成5×5mm的小块。⑵MS＋0.2mg/LIAA＋2mg/LBA27℃、光。⑶25天后，愈伤组织分化芽。一个月后每切块长出2～5个芽。⑷芽转到无激素的MS培养基上，5～10d后形成根。3、胚培养⑴外植体的制备授粉后30～40d果实—95%乙醇消毒—5%NaCl中5min—无菌蒸馏水充分淋洗除去种子上的胶状复被。⑵培养基MS附加硫胺素3.0um。pH6.0。附加2.4－D9.05um,IiP4.92um和椰乳100ml/L的MS用做愈伤组织启动和保存培养基。⑶培养条件愈伤组织启动和保存暗培，27℃。再生生根20～30℃、16h/d，荧光下进行二、甘蓝1、取材和处理剥去叶球的叶片，留下中心柱和腋芽，—70%酒精1-2分钟—0.2%升汞10-15分钟—剥离腋芽—接种在繁芽培养基上（MS+IAA0.2-0.5mg/L+6BA1.0-3.0mg/L）2、培养光照1000-3000lx,12-13h/d,20±2℃，湿度50%-60%。3、扩大繁殖重复进行扩繁，直到达到要求繁殖数量为止。第四节观赏植物的组织培养兰花兰花系兰科植物，在自然条件下主要靠分株繁殖，繁殖率一年只有几倍，所以无法大量繁殖生产，而且由于长期进行无性繁殖，带病毒株增多，逐渐使种性降低，影响生长。1、取材和处理切取lOcm长生长健壮的茎尖，去苞叶洗净—75％酒精—5％的漂白粉10min—无菌水冲洗—接种。在兰花叶片组织培养中，应选择带有嫩叶的花梗，以后的处理方法同茎尖。2、原球茎的诱导培养茎尖生长点或叶片接种在原球茎诱导培养基上。因兰花种类而异，可以用固体培养基或液体培养基(液体培养基中应加比较多的蔗糖)。凡原球茎切口处不变褐或变褐物质排出量较少的种类，可用固体培养基，而易变褐的种类，最好用液体培养基，诱导温度应于23℃，光照强度1500-20001x。原球茎的增殖3、苗的分化培养兰科植物与其他草本花卉不同，它不易受生长调节物质的影响，一般是将原球茎转入离子浓度较低的培养基中，加入一些如椰子汁等天然提取物质，效果会更好，原球茎很快再生成植株。lcm高的幼苗转移到壮苗培养基上培养3～6个月，使其长3～4片叶、3～4条根、3～10cm高，可移栽在泥炭和蛭石中，保湿弱光施肥。原球茎再分化蝴蝶兰第五节药用植物离体培养芦荟芦荟不能自花授粉结实，因此，用种子繁殖非常困难。目前的繁殖方法主要是分株和分蘖，但难以快速、大量地繁殖种苗，这也是当前芦荟种苗昂贵的重要原因之一。（一）材料和培养基取l0-l5cm高的芦荟幼苗诱导培养基为MS+(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA分化培养基为MS+(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA生根培养基为MS+(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)PP333（二）繁殖方法1、愈伤组织培养茎尖部分—75%乙醇30-60s—升汞5-l0min—无菌水冲洗数次—解剖刀取出组织切块—接种培养条件:光照10-12h，1000一2000Lx，(25士)2℃。15-25d后，可膨大成愈伤组织，1周后，就可将愈伤组织转管进行继代培养或分化培养。2、继代、分化培养同诱导3、生根培养培养条件同分化，半个月后即可生根。4、炼苗清水喷湿，在15-25℃、湿度60%-80%的条件下炼苗24h，也可视情况缩短为l2h。5、移栽将幼苗移栽入由蛭石组成的驯化苗圃中驯化，定期喷施驯化培养液和清水，15-20d后，即可移栽。第六节树木的离体培养银杏是园林绿化的珍贵树种，亦有较高的药用价值，以叶及种皮入药，它的叶的制剂能显著扩张脑血管，可治疗脑血栓、冠心病、心肌梗塞及大动脉炎等。种仁、有小毒、性平、有敛肺、定喘等功能。因此可说全身都是宝。但常规繁殖较难，因此组织培养有很大应用价值。胚培养（一）取材：选择生长饱满的银杏种子。（二）操作：1、升汞进行表面消毒，无菌条件下剥除外皮和胚乳。接种在MS培养基上。培养条件：光照1500LX，温度25度。2、愈伤组织的诱导：1/2MS+IBA浓度梯度（1、3、5、7、10PPM）诱导愈伤组织。将培养3天后的银杏胚接种在此培养基上，诱导出大量的愈伤组织。3、愈伤组织继代培养：MS+1.0mg/LNAA+0.1mg/LKT，24—26℃，24h光照培养。20天继代一次。4、生根培养：1/2MS+0.2-0.5mg/lNAA目前有人用根太阳（生根剂）0.5PPm+1/2MS培养基（三）扩大繁殖和炼苗移栽按常规方法即可思考1、说明马铃薯微型薯的生产技术2、查阅资料，了解我国脱毒种苗生产现状3、查阅资料，了解我国兰花组培生产特点4、查阅资料，了解我国药用植物组培技术情况5、查阅资料，了解我国林木组培生产状况