31植物组织培养技术

课题1菊花的组织培养大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？组织培养营养繁殖扦插嫁接压条扦插嫁接压条1.指在无菌条件下，将植物的茎尖、茎段、或叶片等切成小块，培养在特制的培养基上，通过细胞的增殖与分化，使它逐渐发育成完整的植物的技术又称：植物离体培养一、植物组织培养离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化根芽植物体2.植物组织培养的基本过程处于离体状态3.必要条件：一定的营养物质、激素和其他外界条件4.原理:细胞的全能性A.外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官.5.相关概念:（原因）生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因B.脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。C.再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程D.愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞.E细胞的分化（特征）指在生物个体发育过程中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。人参的愈伤组织菠萝的愈伤组织1.细胞分化是生物界普遍存在的一种生命现象，下列叙述正确的是()①细胞分化就是细胞在形态和结构上发生稳定性差异的过程②分化是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果③未离体的体细胞一般不会表现出全能性④分化过程中遗传物质会改变a．①②b．②③c．①②③d．①②③④b2下列关于全能性的叙诉正确的是（）A酵母菌出芽生殖是全能性B花药离体培养的结果没有体现全能性。C植物细胞均具有全能型D多细胞动物细胞核具有全能性D二、影响植物组织培养的因素：②同一种植物的不同组织、年龄、保存时间的长短也会影响实验结果。①不同植物的组织培养难易程度不同1、外植体的选取例如，烟草和胡萝卜的组织培养较为容易，而枸杞愈伤组织的芽诱导就比较难。因此，植物材料的选择直接关系到实验的成败。菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。2、培养基的配制(MS培养基)大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等3、不同植物激素使用顺序使用顺序实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于细胞分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高口诀·：生前分裂不分化，生后分裂有分化，同时提高分化率4、不同植物激素使用量生长素/细胞分裂素比值结果比值高时促根分化，抑芽形成比值低时促芽分化，抑根形成比值适中促进愈伤组织生长口诀：生大根，分大芽，等愈伤（生大表示生长素多，分大表示细胞分裂素多）5、其他因素：pH、温度、光照等不同植物对各种条件的要求不同。进行菊花组织培养一般将PH控制在5.8左右，温度控制在18-22℃并且每日光照12h（注：愈伤组织的形成需要避光培养，原因，有光时，愈伤组织的形成变慢）6、消毒在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境3某同学在进行组织培养过程中，发现愈伤组织只分裂而不分化出芽和根，可能原因是（）A未见阳光B培养时间不够C培养基中的营养过多D细胞分裂素和生长素配比不对D4.美国科学家将分离得到的成熟胡萝卜根的韧皮部细胞进行培养，由单个细胞发育成完整的新植株(如下图)。请分析：(1)这种生殖方式属于_______，所用的技术是_________。(2)分离出来的胡萝卜根细胞成为细胞团是通过________分裂来完成的。(3)细胞团中的相同的细胞在发育成胚状体和植株过程中，形态、结构和生理功能上出现了差异，这种现象叫做细胞的_____________。(4)本实验说明植物细胞具有________________。(5)在培养试管植物时，试管内应至少放入_____种矿质元素。其中应大量供给的元素是______________元素。植物缺少Ca时首先受到损伤的部位是________。(幼叶/老叶)。1)无性生殖植物组织培养(2)有丝(3)分化(4)全能性(5)N、P、K、S、Ca、Mg幼叶（一）制备MS固体培养基（二）外植体消毒（三）接种（四）培养（五）移栽（六）栽培二、实验操作二、实验操作（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备1、配置各种母液为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，减少工作量，可以将各种成分按比例配置成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比所需浓度高10－100倍的母液。使用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量502、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml①配制培养液配制1LMS培养基，先将称好的琼脂加800ml蒸馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖30g，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000ml②调PH③培养基的分装由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌1、选材：（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟1、接种室消毒2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约0.5-1cm）。左手持锥形瓶。右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接种6－8块外植体。接种后，将封口膜重新扎好4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒。培养温度控制在18-22℃，并且每日用日光灯光照12h。（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间（六）栽培3、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花三、课题延伸1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养.2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季.植物组织培养之所以发展如此之快，应用的范围如此之广泛，是由于具备以下几个特点：①培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。②生长周期短，繁殖率高生长较快。植株比较小，往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。本课题内容小结菊花组织培养基础知识实验操作植物体的组织培养影响组织培养的因素细胞分化细胞全能性组织培养过程营养激素环境条件MS固体培养基制备外植体消毒接种培养移栽栽培作业：P361、在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作。2、在选取菊花茎段是，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。练习1、下图是植物组织培养的简略表示。据此回答：（1）①表示__________，它能被培养成为④的根本原因是_______________________。（2）②表示____________，它与①相比分化程度__________，全能性____________.（3）若想制成人工种子，应选用____________。（4）若①是花药，则④是____________，继续对其使用____________处理可获得____________正常植株，该过程称为__。（5）若①是胡萝卜根尖细胞，则培养成④的叶片的颜色为____________，这说明____________。（6）若利用此项技术制造治疗烫伤、割伤的药物——紫草素，培养将进行到____________。④①脱分化②再分化③答案：（1）离体的植物组织或器官植物细胞具有全能性（2）愈伤组织低高（3）③（4）单倍体植株秋水仙素纯合体单倍体育种（5）绿色含有表达叶绿体的基因（6）②练习2、基因型为AaBb的水稻（含24条染色体）的花药通过无菌操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，问：（1）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得_____________等营养物质。（2）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_____________和_____________两类激素。（3）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是_____________能利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。（4）试管苗的细胞核中含_________条脱氧核糖核苷酸链。（5）培育成的试管苗可能出现的基因型有_____________。答案：（1）水、无机盐、维生素和小分子有机物（2）细胞分裂素植物生长素（3）叶绿体（4）24（5）AB、aB、Ab、ab