医学免疫学培训课件-免疫学技术

免疫学检测:应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段。免疫学技术的应用:疾病的诊断、发病机制的研究、病情监测与疗效评价等。一、抗原抗体反应的特点：1.高度特异性:交叉反应2.比例性：最适比例3.可逆性：非共价结合（氢键、疏水键等）4.两阶段：特异性结合阶段：抗原＋抗体可见反应阶段：复合物＋复合物第一节抗原-抗体反应特异性(specificity)：是指任何一种抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结合而起反应的专一性能。特异性是抗原抗体反应的最重要特征之一，是由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补决定区决定的。交叉反应A抗原表位1表位2（Ab1）B抗原表位3表位1（Ab2）比例性：是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见反应。最适比：最迅速出现可见反应时抗原抗体的浓度比或量称为抗原抗体反应的最适比。亦称为抗原抗体反应的等价点。等价带、前带、后带Ag过剩比例适当Ab过剩网格学说示意图Ag-Ab最适比例可逆性reversibility：是指抗原与抗体结合形成的复合物，在一定的条件下可解离为游离的抗原与抗体的特性。解离的抗原和抗体仍保持了原来是理化特性及生物学性状。特异性结合阶段：几秒钟至几分钟即可完成反应的可见阶段：在Ag、Ab特异结合的基础上，受环境中电解质、温度、pH、补体等因素的参与和影响，表现为凝集、沉淀、补体结合、细胞溶解等反应，历时较长，但单价Ab或半Ag，则不出现可见反应。1.抗原抗体的性质：反应物自身因素抗原抗体本身的性质、活性及浓度等。2.温度3.酸碱度4.电解质第二节检测抗原和抗体的体外试验体外的抗原抗体反应常需采用含特异性抗体的血清作试验，故称其为血清学反应。类型：•凝集反应•沉淀反应•补体结合试验•免疫标记技术一、凝集反应（agglutination）颗粒性抗原+相应抗体（细菌、螺旋体、细胞或表面包被抗原的颗粒状物质）适量电解质比例合适凝集肉眼可见的Ag-Ab复合物玻片凝集试验：为定性试验，用于鉴定抗原，如菌种鉴定、ABO血型鉴定等（一）直接凝集反应试管凝集试验：为半定量试验，用于检测抗体的效价，如诊断伤寒、副伤寒的肥达试验1、原理：2、分类：（二）间接凝集反应(indirectagglutinationreaction)：(正向)间接凝集反应：检测未知的Ab,如类风湿因子的检测反向间接凝集反应：检测未知的Ag，如早孕诊断hCG1、原理：将可溶性抗原或抗体吸附于某些载体颗粒上，形成致敏颗粒，然后与相应抗体或抗原进行反应而产生凝集现象二、沉淀反应*原理：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物。*方法:2.速率散射比浊法/免疫比浊法1.琼脂扩散或免疫扩散试验:以半固体琼脂凝胶为介质进行的沉淀反应,包括:单向免疫扩散双向免疫扩散免疫电泳单向与双向琼脂扩散实验原理•单向琼脂扩散实验：可用于血清中免疫球蛋白、C3、AFP或其他可溶性抗原的定量测定双向琼脂扩散试验应用：1）对复杂的抗原/抗体进行纯度鉴定；2）可检测可溶性抗原或抗体；3）进行免疫血清的效价（半定量测定）免疫电泳2.槽内加入抗血清1.抗原分离3.扩散和沉淀应用：对多种抗原成分的复合物进行抗原种类分析，如对血清蛋白的组分分析，用于骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症的辅助诊断速率散射比浊法/免疫比浊法(immunonephelometry)原理:是在一定的抗体中分别加入递增量的抗原,经一定时间后形成免疫复合物，使反应体系呈现不同的浊度。用浊度仪测量液体的浊度，可依据标准曲线推算样品中抗原的含量。优点：快速、简便,取代了传统的环状沉淀和絮状沉淀反应。应用:检测前白蛋白、α2巨球蛋白、尿微量蛋白及血清IgG、IgA、IgM和补体等三、免疫标记技术概念：免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。常用的标记物：荧光素、酶、放射性核素、胶体金及化学发光物质等优点：灵敏度高、快速，可定性、定量甚至可定位检测。常用的免疫标记技术：免疫荧光技术放射免疫测定法化学发光免疫技术免疫胶体金技术免疫印迹法(Westernblotting)免疫酶测定法（EIA）酶联免疫吸附技术（ELISA）酶免疫组化法（一）免疫荧光法（immunofluorescence,IF）是用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。常用荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）：发黄绿色荧光藻红蛋白（PE）：发红色荧光直接免疫荧光与间接免疫荧光（二）酶免疫测定法（enzymeimmunoassay，EIA）是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。其将抗原抗体的特异性与酶的高效催化作用相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）等。结果判断可用目测法，也可用酶标测定仪测定光密度（OD）值以反映抗原含量，灵敏度可达ng/ml甚至pg/ml水平。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织或细胞中的抗原。1.酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunospotassay,ELISA）既可检测抗原，又可检测抗体简便、快速，灵敏度高，应用最广泛ELISA法包括：双抗体夹心法、间接ELISA、BAS-ELISA和微粒捕获酶免疫分析技术（MEIA）等。包被一抗加入抗原加入酶标的一抗加入反应底物测量光密度洗涤洗涤洗涤ELISA双抗体夹心法示意图ELISA双抗体夹心法原理与步骤：将识别细胞因子等的抗体包被于特制酶标板的PVDF膜或硝酸纤维膜上，加入待检的活细胞孵育，细胞所分泌的细胞因子立即与膜上包被的抗体特异性结合，洗涤去除细胞后，依次加入酶标二抗及沉淀性显色底物，即可在分泌相应细胞因子的细胞所处局部的膜表面显现有色斑点，一个斑点表示一个分泌某种细胞因子的细胞，通过计数可以推算出这种细胞的频率。1.B细胞杂交瘤的筛选。2.抗原表位肽的筛选。3.疫苗研究中的评估。4.疫苗生产中的质控。5.化合物和药物免疫学反应的筛选。6.干细胞功能分析。7.优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性。8.自身免疫性疾病的诊断和预后分析。9.自身免疫疾病患者免疫治疗的监控。10.结核病高危人群的筛查。11.过敏性疾病脱敏治疗的监测。12.各种免疫抑制病人的治疗监控。13.器官移植后排斥反应的预测。14.基因治疗中转染效率的检测。15.组织、肿瘤和免疫细胞低频分泌谱的分析等等。1959年创建，具有灵敏度高、特异性强、简便实用、成本低廉等优点原理：Ag*+AbAg*－Ab复合物Ag+Ab*Ag－Ab*复合物必须使用放射性同位素作为标记物，存在着辐射防护及防止污染的问题，试剂盒使用时间短，每次操作都要做标准曲线，可测量范围相对较窄，难以实现操作及测量的自动化等。化学发光检测原理：与RIA相似，区别是用化学或生物发光剂代替同位素。具有试剂稳定、无毒、无放射性，检测程序简便、快速等优点。又称为WesternBlot，包括三个主要步骤SDS-PAGE转移电泳免疫学检测第3节免疫细胞检测对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定。一、外周血单个核细胞（PBMC）的分离葡聚糖-泛影葡胺（淋巴细胞分离液）密度梯度离心法分离PBMC二、淋巴细胞及其亚群的分离（一）免疫吸附分离法(淘选法)将已知针对细胞表面标志的抗体包被培养皿,加入淋巴细胞悬液,表达相应表面标记的细胞即与相应抗体结合,而贴附于固相载体上从而与悬液中的其他细胞分开.利用表面标志分离淋巴细胞亚群(淘选法）（二）磁珠分离法将已知抗细胞表面标志的抗体交联于磁性微珠（平均直径1.5μm),即成为免疫磁珠,将其与细胞悬液反应后,磁珠借抗体结合于相应细胞群或细胞亚群表面.再将细胞悬液加于一试管内并置磁场中,因免疫磁珠被磁场吸引,就可将免疫磁珠结合的细胞与未结合的细胞分离开来.如借此可分离获得高纯度的CD4+T细胞.MACS微珠进行磁性标记未标记的细胞先行流出洗脱阳性分选的细胞免疫磁珠分离(IMB):淋巴细胞亚群（三）荧光激活细胞分选仪分离法(FACS)FACS又称流式细胞术(flowcytometry）在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测技术；综合性的高科技方法:激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术；速度快、精度高、准确性好三、免疫细胞功能的测定（一）T细胞功能测定：1.T淋巴细胞增殖(转化)试验：PHA、ConA等丝裂原以及抗CD3单克隆抗体等能非特异地活化培养的T细胞使其淋巴母细胞化，并使其增殖。在此过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质的合成增加，细胞形态改变，最终细胞分裂。•形态计数法•3H-TdR或125I-UdR掺入法•MTT比色法2.检测迟发型超敏反应(DTH)的皮肤试验如:结核菌素试验念珠菌素试验链激酶-链道酶试验阳性反应：72h后局部皮肤红肿硬结（二）B细胞功能测定1.血清Ig含量的检测：单向琼脂扩散实验、ELISA、免疫比浊法检测IgG、IgA、IgM的含量2.抗体形成细胞测定(1)溶血空斑形成试验(2)酶联免疫斑点法(ELISPOT):一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。（三）细胞毒试验检测CTL、NK等杀伤靶细胞活性方法：51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法(四)吞噬细胞功能测定（1）硝基四氮唑蓝(NBT)试验NBT是一种水溶性的淡黄色染料，被吞噬细胞吞入胞浆后，可被胞内产生的反应性氧中间物–超氧阴离子（O-2）还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数NBT阳性细胞，可反映中性粒细胞的杀伤功能。（2）巨噬细胞吞噬试验二、细胞因子的检测生物学活性检测法免疫学检测法①ELISA(双抗体夹心法)检测②流式细胞术:检测胞内细胞因子③酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测：可检测T细胞产生的细胞因子和B细胞分泌的特异性抗体第四节免疫分子的检测一、补体测定（一）免疫学检测方法的评估与选择金标准真、假阳性真、假阴性特异性＝真阴性/（真阴性＋假阳性）×100％敏感性＝真阳性/（真阳性＋假阴性）×100％-+-+resultfact（二）、疾病的诊断应用已知Ab（或Ag）检测未知Ag(或Ab），从而为感染性和非感染性疾病提供诊断或辅助诊断1、传染病实例：细菌性疾病:应用直接试管凝集反应辅助诊断肠热症(肥达氏反应)病毒性疾病:HBV感染的诊断-ELISA检测乙肝“两对半”HIV感染的诊断：初筛-ELISA、RIA检测HIV抗体确诊：免疫印迹技术检测HIV抗体2、免疫缺陷病实例：抗体缺陷：免疫比浊法检测Ig（Bruton病）吞噬细胞功能缺陷：NBT试验辅助诊断CGD补体缺陷：检测C1INH-遗传性血管神经性水肿的诊断3.自身免疫病实例SLE:初诊-检测抗核抗体确诊-检测抗双链DNA（ssDNA）抗体RA的辅助诊断就：间接乳胶凝集试验检测RF4、超敏反应性疾病实例新生儿溶血症的诊断-Coomb，s试验检测抗Rh抗体5、肿瘤实例原发性肝癌的辅助诊断-检测AFP直肠结肠癌的辅助诊断-检测CEA6.其他早妊诊断-胶体金(斑点金)免疫层析试验检测HCG血型鉴定-直接玻片凝集反应鉴定ABO血型(三)免疫学监测1.检测未知Ag(或Ab）从而为监测疾病过程、判断疗效及预后参考:2.监测乙肝病毒抗原与抗体的消长有助于乙肝的预后判定3.CD4+T细胞计数有助于艾滋病的诊断、病情分析、疗效判定4.肿瘤相关抗原的监测，有助于了解肿瘤的发展与预后判定5.组织器官移植后对受者的免疫学监测有利于排斥反应的早期发现