利用16S-rRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定

利用16SrRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定【实验目的】1.了解微生物分子鉴定的原理和应用。2.掌握利用16SrRNA基因进行微生物分子鉴定的操作方法。3.运用软件构建系统发育树并对微生物进行系统发育关系分析。【实验原理】长期以来，对微生物的分类鉴定主要采用分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等方法。但这些传统手段均存在耗时长、特异性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求。随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应(PCR)技术的出现及核酸研究技术的不断完善，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因（即rDNA）指纹图、16S核糖体核糖核酸（ribosomalRNA，rRNA）序列分析等。这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。其中原核生物16SrRNA基因（真核18SrRNA基因）序列分析技术已被广泛应用于微生物分类鉴定。核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。其中16SrRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”。在16SrRNA分子中含有高度保守的序列区域和高度变化的序列区域，因此很适于对进化距离不同的各种生物亲缘关系的比较研究。其具体方法如下：首先借鉴恒定区的序列设计引物，将16SrRNA基因片段扩增出来，测序获得16SrRNA基因序列，再与生物信息数据库（如GenBank）中的16SrRNA基因序列进行比对和同源性分析比较，利用可变区序列的差异构建系统发育树，分析该微生物与其他微生物之间在分子进化过程中的系统发育关系（亲缘关系），从而达到对该微生物分类鉴定的目的。通常认为，16SrRNA基因序列同源性小于97%，可以认为属于不同的种，同源性小于93~95%，可以认为属于不同的属。系统进化树（系统发育树）是研究生物进化和系统分类中常用的一种树状分枝图形，用来概括各种生物之间的亲缘关系。通过比较生物大分子序列（核苷酸或氨基酸序列）差异的数值构建的系统树称为分子系统树。系统树分有根树和无根树两种形式。无根树只是简单表示生物类群之间的系统发育关系，并不反映进化途径。而有根树不仅反映生物类群之间的系统发育关系，而且反映出它们有共同的起源及进化方向。分子系统树是在进行序列测定获得分子序列信息后，运用适当的软件由计算机根据各微生物分子序列的相似性或进化距离来构建的。计算分析系统发育相关性和构建系统树时，可以采用不同的方法如基于距离的方法[UPGMA、ME（MinimumEvolution，最小进化法）]、NJ（Neighbor-Jioning，邻接法）、MP（MaximumParsimony，最大简约法）、ML（MaximumLikelihood，最大似然法）和贝叶斯（Bayesian）推断等方法。构建进化树需要做Bootstrap检验，一般Bootstrap值大于70，认为构建的进化树较为可靠。如果Bootstrap值过低，所构建的进化树的拓扑结构可能存在问题，进化树不可靠。一般采用两种不同方法构建进化树，如果所得进化树相似，说明结果较为可靠。常用构建进化树的软件有Phylip、Mega、PauP、T-REX等。本实验以枯草芽孢杆菌的鉴定为例，应用16SrRNA基因序列分析技术进行微生物鉴定的实验。【实验用品与仪器】1．菌种和质粒（1）菌种：枯草芽孢杆菌，E.coli（2）质粒：pMD18-T载体2．培养基LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1L，pH7.2。3．试剂和溶液琼脂糖、细菌基因组提取试剂盒、dNTP、DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、X-gal、IPTG、限制性内切酶SpHI和PstI等。4．仪器设备及其他PCR仪、电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、超净工作台、摇床、电子天平、恒温培养箱等。【实验内容】1．设计合成引物使用16SrRNA全长通用引物。引物1：5′-AGAGGTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物2：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。提交基因合成公司合成。2．PCR扩增16SrRNA基因片段以基因组DNA为模板，最适量为0.1~1.0ng，过多可能引发非特异性扩增，过少可能扩增失败PCR体系一般用25L，使用保真度较高的DNA聚合酶。反应体系：模板L引物L引物LdNTPLTaq酶（5U/ml）LL灭菌水至LPCR反应：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸90s，30个循环。72℃10min。4℃存放。3．琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物配制1%琼脂糖凝胶，取4LPCR产物，混合0.5Ll6×上样缓冲液加样，DL2000Marker作为分子量标准，在1×TAEk，110V电泳45~60min，EB染色，紫外凝胶成像仪中观察。16SrRNA基因片段大约为1.5kb。4．胶回收16SrRNA基因片段（1）电泳配制1%低熔点琼脂糖凝胶，将PCR获得的16SrRNA基因与上样缓冲液混合，加入到一大的胶孔中。4℃，50V恒压电泳2~3h。（2）切胶紫外灯下，用无菌刀片切下条带转移至干净的1.5mL离心管中。（3）胶回收1）准确称量凝胶的重量，按1g≈1mL计，加入5倍体积的TE缓冲液，盖上盖子，于65℃保温5min融化凝胶。2）待凝胶冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚（pH8.0），剧烈振荡混匀20s。20℃，10000r/min离心10min，回收水相。3）加入等体积的酚：氯仿（pH8.0的Tris饱和酚与氯仿等体积混合），剧烈振荡，20℃，10000r/min离心10min，回收水相。4）用等体积的氯仿抽提上清，颠倒混匀，20℃，10000r/min离心10min，回收水相。5）将水相移到一新的1.5mL离心管，加入0.2倍体积的10mol/l乙酸铵和2倍体积的无水乙醇，混匀后在室温下放置20min。然后于4℃，12000r/min离心10min，弃上清，找开管盖，晾干沉淀，将沉淀溶解在一定量的无菌双蒸水中备用。5．16SrRNA基因片段通过pMD18-T载体进行克隆（1）16SrRNA基因片段与pMD18-T载体连接在0.5mL的微量离心管中分别加入以下溶液，16℃连接过夜（12~14h）。pMD18-T载体100ng胶回收的16SrRNA基因50ngT4DNA连接酶1L2×连接缓冲液5L无菌双蒸水至10L（2）转化将连接好的载体在冰上放置5min，然后全部加入到装有200LE.coliDH5a感受态细胞的微量离心管中，用预冷的移液枪头轻轻混匀，置于冰上5min。然后在42℃水浴热击90s，迅速将离心管转移到冰上，放置5min。将转化细胞转移到10mL无菌试管中，加入1mL37℃预热的LB培养基，37℃，200r/min振荡培养1h。（3）重组子的筛选将上述培养液涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上，37℃恒温培养过夜，出现白色菌落一般是重组子。（4）重组子的酶切鉴定挑取几个白色菌落，分别接种到含有终浓度100g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。用碱法提取转化子质粒。用限制性内切酶SphI和PstI，37℃酶切2~3h。将酶切产物加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察1.5kb左右的酶切条带，证明是正确的重组子。6．16SrRNA基因的序列测定将验证正确的重组子交给专业测序公司完成测序。7．序列分析与系统发育树的构建（1）相似序列的获取用BLAST生物信息数据库搜索功能进行在线相似性搜索，选择几个已知分类地位的相似序列。（2）多重序列比对分析用ClustX软件对多个相似序列进行多重序列比对分析。（3）构建系统发育树利用Mega4软件构建系统发育树。（4）系统发育关系分析【实验结果与分析】1．将PCR扩增的凝胶电泳结果扫描图打印出来，并对结果加以分析说明。2．对重组子筛选平板上的菌落特征进行描述和分析。3．对PCR产物进行测序所得的序列进行序列特征分析。4．对基于16SrRNA基因的序列构建的系统发育树进行系统发育关系分析。【思考题】1．16SrRNA基因的序列有什么特征？2．利用16SrRNA基因序列分析方法获得的鉴定结果与菌株已知的分类结果是否一致？若不一致，如何确定其准确的分类地位？附录：用Mega4构建系统发育树的过程1.利用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)数据库搜索程序获得16SrRNA相似序列登录到有BLAST服务的网站，如美国国立生物技术信息中心NCBI（）。进入BLAST主页界面，选择nucleotideblast（blastn），把要搜索的DNA序列以FASTA格式粘贴到Search栏，Database选项选择Others，点击BLAST，得到resultofBlast，选项中序列以FASTA格式保存。错误!未找到引用源。gb|HQ185400.1|Stenotrophomonasmaltophiliastrain563316SribosomalRNAgene,partialsequenceLength=1540Score=2663bits(1442),Expect=0.0Identities=1457/1464(99%),Gaps=1/1464(0%)Strand=Plus/PlusBlastn结果中参数含义：Score是指提交的序列和搜索出的序列之间的分值，越高说明越相似；Expect（E值）是指比对的期望值，比对越好E值越小，一般在核酸的比对，E值小于1e-10，比对就算是很好，多数情况下为0；Identities是指提交的序列和参比序列的相似性，如上所指序列为1464核苷酸中二者有1457个相同；Gaps指的是对不上的碱基数目；Strand为链的方向，Plus/Minus指的是提交的序列与参比序列是反向互补的，如果是Plus/Plus则二者皆为正向。2.利用ClustalX进行相似序列的多重比对将检测序列和搜索保存的同源序列以FASTA格式编辑成为一个文本文件，导入ClustalX程序进行多重比对，在Alignment菜单中点击DoCompleteAlignment，保存自动生成的*.aln和*.dnd文档。3.使用MEGA(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis)软件构建系统发育树（1）打开MEGA4.0.2程序，如下图。（2）MEGA4.0.2只能打开meg格式的文件，先将ClustalX输出的.aln文件转换为meg格式的文件。点File：ConverttoMEGAFormat…，打开转换文件对话框（如下图）。（3）选择文件和转换文件对话框，选择.aln文件，点OK（如下图）（4）转换成meg文件后查看meg序列文件最后是否正常，若存在clustal.*行，即可删除。点存盘保存meg文件，meg文件会和aln文件保存在同一个目录（如下图）。（5）退出转换窗口，回到主窗口。点击步骤1中的“Clickmetoactivateadatafile”打开转换后的meg文件，选择序列数据类型，点击OK（如下图）。（6）数据打开后出现两个窗口，主窗口下面有序列文件名和类型。另一为序列数据窗口，出现以下数据文件点击选择和编辑数据分类图标，可对所选择的序列进行编辑，完成后点击close即可。（7）构建进化树的算法主要分为两类：独立元素法（discretecharactermethods）和距离依靠法（distancemethods）。所谓独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的（例如：一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点