免疫组织化学染色技术

免疫组织化学染色技术法医学院官大威.第一节常规组织学染色技术概述宏观微观超微结构基因水平组织形态学研究技术的种类：一、病理大体组织标本的染色方法在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：¾脂肪组织染色法目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ结果：病变处脂肪组织呈橙黄色¾早期心肌梗死染色法目的：显示早期心肌梗死的区域试剂：0.1%NBT(硝基四唑蓝)/0.2mol/LPBS(pH7.6)方法：将2-3mm厚新鲜心肌大片放入试剂中，37°C孵育20min。结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。注意：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。二、光学显微镜下的组织学染色方法•常规HE染色（hematoxylinandeosinstaining）•组织学特殊染色1.Mallory三染色、Masson三染色2.神经纤维的镀银染色3.其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞DNA和RNA的染色等上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。三、超微结构的观察•光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2μm有效放大倍数昀高不超过2000倍。•电镜的分辨率昀佳可达0.14nm，放大倍率昀高可达100万倍。第二节免疫组织化学染色技术Immunohistochemicaltechnique由于该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术。根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：1.免疫荧光细胞化学技术2.免疫酶细胞化学技术3.免疫铁蛋白技术4.免疫金-银细胞化学技术5.免疫电子显微镜技术一、免疫组织化学染色方法的原理•抗原（antigen）1.定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。抗原具有两种性能：（1）免疫原性（immunogenicity）指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。（2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗体或效应T细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。2.抗原的分类完全抗原、半抗原免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等临床分类同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原•抗体（antibody）1.定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。大部分抗体电泳后位于γ区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。2.抗体的种类:五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。•免疫组织化学染色的反应原理及显色原理1.免疫组织化学染色的反应原理Å染色反应的昀基本原理是抗原抗体的反应。Å通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原是否存在。Å通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。2.免疫组织化学染色的显色原理(1)基本原理荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用昀为广泛。n直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。n间接法：是将酶标记在第二抗体上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。X间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体，单克隆抗体是由小鼠制备的。X第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属动物，同标记的第二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。X通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化学染色的敏感度。IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。（2）显色的基本程序1抗孵育切片或细胞涂片2抗（酶标抗体）孵育切片发色剂显色（核复染）（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂œ辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）HRP+H2O2HRP·H2O2HRP·H2O2+DH2HRP+D+2H2OHRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使反应的终产物呈现不同的颜色，如：CN（4-chloro-1-naphthol）为蓝色TMB（tetramethyl-benzidine）为深蓝色AEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）为红色DAB（3，3-diaminobenzidine）为棕色碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)是以AS-Mx为底物，FB/FR(Fastblue/Fastred)为发色剂，生成蓝色/红色不容性沉淀物。ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。由于组织细胞内含有内源性ALP，在显色液中需加入终浓度为2-4mol/L的左旋咪唑(levamisole)，大多数内源性ALP活性可被抑制。ž葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS(phenazinemethyl-sulfate)0.167mg、0.05mol/LPBS(pH8.2)10.0ml，37ºC孵育1小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、透明后封片，长期保存。（4）核复染在显色后，特别是用DAB显色后，切片可用苏木素染料进行核复染，经水化后细胞核显示蓝色，与胞质中的DAB棕色形成对比。但用AEC显色后不能用苏木素做核复染，因为配制苏木素染料中使用酒精作为介质，可使AEC的红色终产物褪色，且AEC显色后只能用水溶性封固剂封片。第三节免疫组织化学染色步骤（一）ABC或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤1.组织材料的采取；2.组织块的固定；3.组织块的脱水、透明及石蜡包埋；4.石蜡切片的制备；5.石蜡切片的脱蜡及水化；6.抑制内源性过氧化物酶活性；7.PBS洗涤切片；8.抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原；9.PBS洗涤切片；10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清(或同时加入BSA)孵育切片，防止抗体的非特异性吸附；11.用特异性一抗(单克隆、多克隆)孵育切片；12.PBS(可加入Tween20#，PBST)洗涤切片；13.用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；14.用PBS或PBST洗涤切片；15.滴加SP试剂或ABC试剂；16.PBS或PBST洗涤切片；17.DAB或AEC显色；18.自来水洗涤切片，终止显色；19.用苏木素做核复染；20.切片脱水、透明，树胶封片。（二）各染色步骤的具体操作及注意事项1.组织材料的采取活检组织组织标本手术切除标本尸检标本实验组织或培养细胞‘活检组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织C体积小，因活检钳直接钳取，常受压过度而变性，因此，活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的病灶区。C抗原在组织中的分布不均一，故病灶较大的切除标本应考虑切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。’尸检组织由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同程度自溶，其抗原或变性消失或有严重的弥散现象。法医尸检一般多在24小时以上，甚至数月后，检材受死后变化影响严重，而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜，取材后应立即固定，以保存组织结构和抗原。“实验动物标本新鲜，可按需要取材，特别是很多情况下是在灌流固定后取材，组织结构和抗原保持良好，非常适用于免疫组织化学染色。”取材标本的大小尸检组织材料大小以1cm×1cm×0.2cm为宜。实验动物常用大鼠或小鼠，其脏器体积小，有利于取材。一般标本体积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。2.组织块的固定、水洗（1）固定液：种类较多，常用的有以下几种：L4%甲醛/PBS(pH7.2-7.4)配制方法：10ml40%甲醛(formalin)+90mlPBS使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)，还可形成甲酸，影响染色结果。L4%多聚甲醛/PBS(pH7.2-7.4)配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500ml0.1mol/LPB(pH7.2-7.4)，搅拌、加热至60ºC，同时滴入1NNaOH至溶液完全透明。冷却后用1NHCl调PH值至7.2-7.4，再用0.1mol/LPB将溶液加至1000ml。¶固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。¶固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。¶不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。（2）水洗³冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗24小时，小动物组织冲洗2-10小时。³新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，固定时间长的标本，冲洗时间也需延长。³冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一端接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或将组织块放入洗涤筐中，放在水盆内冲洗。³对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水浸泡即可。3.组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋（1）脱水脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，昀常用酒精。酒精可以与水以任何比例混合，脱水能力强，并可硬化组织。酒精对组织的穿透速度很快，对组织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩，应从低浓度开始，然后再依次增加其浓度。在常温下或4ºC下进行，以减少抗原的损失。70%80%90%95%100%100%（2）透明I为使石蜡能浸入组织块，组织经脱水后，必须经过一种既能与酒精形容，又能溶解与石蜡的溶剂。通过溶剂的媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。I透明剂：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，昀常用二甲苯。I一般经过2-3次纯二甲苯溶液透明，每次10-15分钟，同时也应根据组织的种类和组织块大小以及二甲苯的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。（3）浸蜡组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。F为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡浸渍。F用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温蜡，在60ºC以下浸透。（4）包埋浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡到入包埋盒，冷却后取出，修块。4.石蜡切片的制作（1）载玻片涂片的制作R防脱片剂：APES（3-aminopropyltriethoxysilane）、多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明胶。‘APES涂片的制作原理：APES是一种新型玻片粘附剂，与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。具体操作方法：将载玻片用酸处理后，用95%酒精浸泡，再用绸布擦干，清除表面的污渍；将干净的载玻片放入丙酮内5min；将载玻片用镊子夹住浸入APES试剂（1mlAPES+50ml丙酮）1-2次；纯丙酮内洗2次后，37ºC过夜，干燥；用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。’多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，PLL）