加速衰老小鼠脑组织中的衰老相关基因的表达(

1加速衰老小鼠脑组织中的衰老相关基因的表达张冲1,2程锦雁1王锦刚3陈清轩1*1．中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京100080；2．国科学院研究生院，北京100039；3.北京灵泰必成医药技术有限责任公司北京100086.摘要从分子水平上研究衰老对大脑的影响有助于揭示机体衰老的分子机理，也有助于揭示衰老相关性脑功能异常的发生过程。本研究应用DDRT－PCR方法研究衰老相关基因在SAM（Senescence-AcceleratedMouse）小鼠脑组织中表达的变化情况。在SAMR1TA、SAMP8/Ta、SAMP10/Ta三个品系中，通过比较不同鼠龄SAMP10/Ta（2、4、12、18月龄）的基因表达情况，发现在4月龄和12月龄分别有一个差异表达片段；对不同鼠龄的SAMP8/Ta（2、4、11月龄）经差显比较,发现在2月龄和11月龄各有一差异表达片段。在不同品系的比较中发现了16个差异性片段，分别属于SAMP10/Ta(3个)、SAMP8/Ta(6个)和SAMR1TA（7个）。测序结果经检索显示，它们分别与下列基因转录产物同源：热休克识别蛋白－70、ATP依赖性线粒体RNA螺旋酶、DleumRNA、小鼠X染色体RP23-334C4克隆DNA序列、还原型辅酶Q-细胞色素c还原酶复合物7.2KD亚单位、60S核糖体蛋白L21、FIS、苯基烷基胺钙离子拮抗物结合蛋白、岩藻糖基转移酶－9、胶质细胞源性神经营养因子家族受体α1、内切核酸酶/逆转录酶、PER1蛋白相关超级融原核蛋白、中心体蛋白CG-NAP、转铁蛋白重链基因、巢蛋白-2基因、DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位基因prkdc[动物学报50（4）-，2004]。关键词加速衰老小鼠衰老相关基因表达逆转录差异显示聚合酶链式反应脑组织Expressionsofageing-associatedgeneincerebraltissueofsenescence-acceleratedmouse*ZhangChong1.2ChengJin-Yan1WangJin-Gang3ChenQing-Xuan1**1.InstituteofGeneticsandDevelopmentalBiology,TheChineseAcademyofSciences,Beijing100080,China2.GraduateSchoolofChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China3.LingtaiBichenMedicalTechnologyCo.Ltd.Beijing,100086,ChinaAbastractAbetterunderstandingofthemoleculareffectsofageinginthebrainmayhelptorevealimportantaspectsoforganismalageing,aswellasprocessesthatleadtoageing-relatedbraindysfunction.Inthisstudy,theageing-specificexpressiongenesofthemurinecerebrumwereinvestigatedbyemployingdifferential-displayreversetranscriptionpolymerasechainreaction(DDRT-PCR)inthreesenescence-acceleratedmouse(SAM)strains:SAMP8/Ta,SAMP10/TaandSAMR1TA.Throughcomparedgeneexpressionprofileamongtheage18,2004-03-18收稿，2004-05-18接受国家重大基础研究规划项目（973）（No.2000016107）和北京灵泰必成医药技术有限公司资助[ThisresearchwasfundedbythegrantsfromtheStateBasicResearchDevelopmentProgram“973”(No.2000016107),andLingtaiBichenMedicalTechnologyCo.Ltd.,Beijing]通迅作者(Correspondingauthor).E-mail:[e-mail]动物学报ActaZoologicaSinica212,4,and2monthoftheSAMP10/Tastrain,twodifferentialfragmentshavebeenfound,whichbelongto4and12monthindividually;andinage11,4and2monthoftheSAMP8/Tastrain,twofragmentshavebeenfound,whichbelongto11and2monthrespectively.Andcomparedgeneexpressionprofileindifferentstrainsmice,16fragmentshavebeendetected,3,6and7ofthembelongtoSAMP10/Ta,SAMP8/TaandSAMR1TArespectively.Sequenceresultsindicatethatthosefragmentsarehomologouswithheatshockproteincognateprotein70，ATP-dependentmitochondrialRNAhelicase,Dleu2mRNA,MouseDNAsequencefromcloneRP23-334C3onchromosomeX,ubiquinol-cytochromecreductasecomplex(7.2kD),60SribosomalproteinL21,FIS,phenylalkylamineCa2+antagonist(emopamil)bindingprotein,fucosyltransferase9,glialcelllinederivedneurotrophicfactorfamilyreceptoralpha1,endonuclease/reversetranscriptase,PER1interactingproteinofthesuprachiamaticnucleushomolog,centrosomalproteinCG-NAP,ferritinheavychaingene,NID-2gene,andprkdcgeneforDNA-dependentproteinkinasecatalyticsubunit[ActaZoologicaSinica50(4):-,2004].KeywordsSenescence-AcceleratedMouse,Ageing-associatedgeneexpression,Differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction;CerebralTissue衰老是指机体达到其最大繁殖能力后生理功能的进行性降低(Royetal.,1996),是一个自发而又与早期的程序化发育相对应的过程。机体的寿命取决于许多因素，其中包括遗传因素（Finchetal.,1997;Pucaetal.,2001）、激素和生长因子信号(Flurkeyetal.,2001;Coschiganoetal.,2000)、体重(Piantanellietal.,2001)、体脂含量和环境因素(Coschiganoetal.,2000;Masoro,2000)等。进化理论认为衰老并非是机体的适应性特征，而是随着时间推移机体许多功能注定丧失的结果。医疗记录也给我们这样的印象：衰老是许多独立导致疾病并最终导致死亡的退行性变化过程的集合(Hekimietal.,2003)。模式动物加速衰老小鼠（Senescence-AcceleratedMouse，SAM）是由一系列相关的纯系所组成，包括9个短寿的加速衰老品系和3个寿命较长的正常衰老的品系（Takedaetal.,1981，1991）。SAMP系小鼠显示系特异性衰老相关的病理表型，包括出现衰老表征提前和寿命缩短。本研究应用了三个品系小鼠作为研究对象，以期发现衰老相关表达的基因。其中，SAMP8/Ta与SAMP10/Ta表现为短寿及与鼠龄相关的学习认知损害、情感紊乱、昼夜节律异常，SAMP8/Ta还表现免疫损害；SAMR1TA则为正常寿命且无衰老相关病理表型的对照系（Takeda，1999）。SAM模式小鼠显示出的加速衰老的病理表型说明：衰老至少从一定意义上来说是受遗传控制的。迄今为止，SAM小鼠己被广泛用于衰老相关性疾病的研究，但很少涉及导致其寿命缩短的分子机理的研究（Zhangetal.,2002;Kumaretal.,2000）。因此，我们应用DDRT-PCR方法对不同鼠龄和不同品系的加速衰老小鼠(SAM)脑组织进行了比较研究，以期找出与衰老相关的基因片段，进而为进一步研究衰老的分子机制打下基础。1材料和方法1.1材料31.1.1实验动物及饲养条件SAMR1TA、SAMP8/Ta、SAMP10/Ta系小鼠购自日本京都大学，在本所实验动物中心按普通级进行饲养，12小时明暗光周期，自由饮水及采食。实验中动物使用饲料为购自军事医学科学院实验动物中心饲料厂的商业化小鼠饲料。1.1.2实验用试剂RNA小量提取试剂盒(Qiagen)、QIAshredderTM(Qiagen)、PCR管（Axygen）、M-MuLV逆转录酶(Biolabs®Inc.)、dNTP(promga)、TaqDNA聚合酶(Promga)、α-32p-dCTP（亚辉）、无RNA酶的DNA酶(Promga)、RNA酶抑制剂(Promga)、尿素（Promga）、糖原(Sigma)、琼脂糖（Biowest）、Wizard®PCRPrepsDNA纯化系统（Promga）、pGEM®-TEasy载体(Promga)、氨苄青霉素(sigma)、IPTG(Promga)、X-Gal(Promga)、DH5α感受态菌（天威时代）、UltraPureTM质粒纯化试剂盒（赛百盛）、X光胶片(FujiPhotoFilmCo.Ltd.)、BDMarathonTMcDNA扩增试剂盒(BDBioscienceClontech)、PROTRAN®硝酸纤维素转印膜(Schleicher&Schuell)、预杂交及杂交液(上海生物工程技术服务有限公司)、随机引物DNA标记试剂盒(TaKaRaBiotechnologyCo.Ltd.)。1.1.3实验用引物:由赛百盛公司合成，序列如下：A1:5’-ACAGAGCACA；APG:5’-AAGCTTTTTTTTTTTTG；APC:5’-AAGCTTTTTTTTTTTTC；APA:5’-AAGCTTTTTTTTTTTTA。1.2方法1.2.1总RNA提取实验用雄性小鼠断颈处死，撕去头部皮肤，打开头盖骨，取出脑组织。切取大脑左前部1/2约30mg,放入玻璃研磨器中，加入裂解液后研磨，按RNeasyminiKit操作方法提取总RNA。经无RNA酶的DNA酶处理后备用。1.2.2RNA逆转录在PCR管中加入2µl总RNA（约1µg）、10XRTbuffer4µl、2.5mMdNTP1.6µl、3’引物2µl、RNA酶抑制剂(40iu/µl)0.5µl、加水至19µl。65℃5min，42℃10min、加入M-MuLV逆转录酶1µl(200iu),37℃50min、75℃5min。1.2.3逆转录产物的PCR扩增反应体系为逆转录产物2µl、10XBuffer2µl、25mMMgCl22µl、2.5mMdNTP1.6µl、5’引物（2µM）2µl、3’引物(2µM)2µl、TaqDNA聚合酶(5