蛋白质工程重点

一、名词解释1、蛋白质工程（ProteinEngineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。2、结构模体（supersecondarystructure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（blockbuilding），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。4、蛋白质的折叠(proteinfolding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。5、分子伴侣（molecularchaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。6、晶胞(Unitcell)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。7、核磁共振现象（nuclearmagneticresonance，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeemansplitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radiofrequency,RF）的物理过程。8、化学势（位）移（）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。二、问答题1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法：随机突变：UV、X射线、其他化学方法、转座元件、简并引物定点突变：核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖1）、Kunkel突变法+dut-ung-双突变菌株添加突变引物在不含U碱基的噬菌体内延伸引物转染于dut+ung+野生型受体菌不含U碱基的保留，含U碱基的被切除原理：当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,MutantUUUUTemplateUUUUUUTemplateUUTemplateUUUUUU因而细菌体内的dUTP浓度大为增加，并且一些dUTP会掺入到DNA合成中应该由胸腺嘧啶占据的位置。而此时大肠杆菌体内还存在一种尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除掺入到DNA中的尿嘧啶残基。但在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷性菌株中（ung-），由于该酶的失活将不能把尿嘧啶从DNA链中剔除，使细菌DNA中一小部分胸腺嘧啶残基被尿嘧啶所取代。在dut-ung-F’菌株中，取代比例有所提高，由该菌株培养的M13噬菌体的DNA中会含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体转染ung+菌株，尿嘧啶被除去，并因此产生一些可阻断DNA合成且对特定核酸酶敏感的位点。病毒DNA被破坏，感染力下降约5个数量级。Kunkel突变法正是利用上述机制，首先在dut-ung-的双突变菌株中培养适当的重组M13噬菌体，制备出带U的单链DNA模板，然后与突变引物退火、引物延伸，然后将延伸反应混合物转染ung+受体菌，模板链因由U碱基位点的存在而被破坏，野生型噬菌体的产生受到抑制。大部分（＞80%）的后代噬菌体是由所转染的不带U的负链复制而来的。由于该链是由突变引物延伸而来的，因此，后代噬菌体多带有突变的目标基因。所以，Kunkel突变法所产生的突变体不需要利用标记的寡核苷酸探针来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体。2）、DpnI法进行定点突变常规大肠杆菌中质粒含DpnⅠ位点添加一对正反向突变引物体外退火延伸模板质粒对DpnⅠ酶敏感，被切除体外合成的突变序列质粒成功转化原理：一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。2、重叠延伸PCR（4个引物）技术（正向引物）（反向引物）（第一轮PCR，共有4种产物）（引物退火变性延伸）（只能5’3’方向聚合）（用DNA聚合酶扩增至完整链）（第二轮PCR）（用两端引物扩增目的基因）原理：由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.3、蛋白质结构测定方法的优缺点1）、蛋白质结构测定方法：X射线晶体结构测定、核磁共振波谱法（NMR）、三维电镜重构。2）、X射线晶体结构测定：SP6primerReversemutagenicprimerT7primerForwardmutagenicprimerFirstPCRRemoveprimersDenatureandanneal3’3’ExtendtofulllengthbyDNApolymeraseSecondPCRSP6primerT7primerDNAcloning优点：分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性的大量信息；缺点：①晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；②很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）③X射线晶体衍射的工作流程较长。核磁共振波谱法（NMR）：优点：①同样具有高分辨率②可以在溶液中操作，接近生理状态③分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理缺点：①样品的分子量要比较小（50KD以下）②对不溶的蛋白比较困难（如膜蛋白）③实验周期长（1年）三维电镜重构：优点：1.可以直接获得分子的形貌信息；2.适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品（如难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等）；3.适于捕捉动态结构变化信息；4.易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；5.电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射线晶体学直接和方便。缺点：①最大的缺点是分辨率较低②对小分子蛋白效果不佳4、X射线晶体结构测定原理、步骤及优缺点1)、原理：1.光的衍射现象2.X射线的发现及应用3.晶体学基础知识4.X射线晶体衍射光的衍射现象衍射现象：光波偏离直线传播而出现光强不均匀分布的现象X射线的发现及应用本质的争论（波动说微粒说）X射线衍射的发现晶体学基础知识X射线晶体衍射2）、X射线晶体结构测定基本过程：①蛋白质获取（提纯）②晶体生长并经冷冻技术处理③重原子衍生物制备④衍射数据收集⑤衍生数据分析和改进⑥结构模型的获取（包括修正）3）、优缺点：优点：分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性的大量信息；缺点：①晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；②很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；③X射线晶体衍射的工作流程较长。三、简答题（有些没听到）1、空间结构组件及其特点α螺旋（αhelix）、Β折叠（βsheet）、环肽链（loop）、转角（turn）1）.α-螺旋结构：•多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构.•肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行(同一方向），具有极性，N(+)、C(-)。•中心无空腔，稳定•蛋白质分子为右手-螺旋。（选）•螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;•沿主链计算，一个氢键闭合的环包含13个原子，3.613•螺旋一侧主要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧主要集中疏水残基•对生物活性具有重要作用•可用螺旋转轮(helicalwheel)的方式预测两亲性2）、Β折叠：•伸展的构象，每圈只有2个氨基酸残基的特殊螺旋•-碳原子处于折叠的角上，R基团处于棱角上与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm•β折叠片也是一种重复性的结构，可以把它想象为由折叠的条状纸片侧向并排而成。肽主链沿纸条形成锯齿状。•氢键是在片层间而不是片层内形成。•折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面，并交替地从平面上下二侧伸出。3）、转角（turn）回折(reverseturn)β转折（转角）(-turn)γ转折(γ-turn)β发夹β发夹(β－hairpin)无规则卷曲2、蛋白质的空间结构层次一级结构、二级结构、结构模体、结构域、三级结构/亚基、四级结构。3、第二遗传密码的定义及其特点定义：无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分—遗传密码的第二部分，蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码。特点：简并性氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。•多意性相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。•全局性在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以影响已经形成的肽段个构象从而造成对分子整体的影响等。4、表达系统宿主的选择：体内翻译系统体外翻译系统：原核生物表达系统：大肠杆菌、枯草杆菌真核生物表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统5、大肠杆菌表达载体的组件复制起始点、选择性基因、多克隆位点（MCS）、启动子(Promoter)、终止子(Terminator)、核糖体结合位点(SD序列)四、其他一）、蛋白质工程绪论1、蛋白质工程化的顺序：工程化：理念－设计－制造－功能实现2、基因工程和蛋白质工程（选）基因工程蛋白质工程相同点都要改造基因，都属于分子水平产生的基因（型）无新基因（型）有新基因（型）产生的蛋白质原有的新的联系蛋白质工程以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸3、酶工程与蛋白质工程的区别•酶工程：酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用和大量制备。•蛋白质工程：重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。4、蛋白质工程产生的标志、研究内容、支撑技术1)、1983年，美国的Ulmer在《Science》上首先提出了“ProteinEngineering“——蛋白质工程诞生(Science,219:666-671.)2）、1.蛋白质结构分析——基础2.结构、功能的设计和预测——基础的应用与验证3.创造和/或改造蛋白质——新蛋白质——终目标3）、蛋白质结构解析技术、生物信息学分析技术、定点突变等遗传操作技术二）、蛋白质结构基础5、氨基酸的构型与构象及多肽链构象的表征参数•构型configuration：一个分子中原子的特定空间排布（L-型的单一手性分子）–构型转化时必须有共价键的断裂和重新形成–不同构型分子除镜面操作外不能以任何方式重合–化学上可以分离，不可由单键旋转相互转换•构象conformation：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布–构象转化时不需要共价键的断裂和重新形成–化学上难以区分和分离表征参数：（1）多肽链的构象角(,)（2）拉氏构