实验一植物组织总DNA的提取及DNA的浓度测定（4学时）

南京晓庄学院生物实验教学中心实验十一植物组织总DNA的提取及DNA的浓度测定•掌握用CTAB法提取植物总DNA的方法和基本原理。•学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液的浓度。一、实验目的南京晓庄学院生物实验教学中心二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。CTAB,SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。南京晓庄学院生物实验教学中心再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。南京晓庄学院生物实验教学中心•DNA的吸收光谱峰在260nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50µg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。•由于蛋白质的吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。南京晓庄学院生物实验教学中心水稻品种的幼苗叶片三、实验材料南京晓庄学院生物实验教学中心四、实验器具、药品试剂水浴锅，研钵，微量移液器，枪头，离心管，台式离心机，液氮，恒温箱，标签纸，紫外分光光度计，磁力搅拌机，剪刀等。2%CTAB抽提缓冲溶液，异丙醇,氯仿-异戊醇等南京晓庄学院生物实验教学中心CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤异丙醇沉淀DNA溶液南京晓庄学院生物实验教学中心五、实验方法(1)2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。(2)取少量叶片（约0.2g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；(3)在液氮挥发将尽而植物组织尚未解冻时迅即加入700µl的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；(4)将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；(5)置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；1.DNA的提取南京晓庄学院生物实验教学中心（6）冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3min，使两者混合均匀；（7）放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；（8）用移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；南京晓庄学院生物实验教学中心（9）10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；（10）60sec后，直立离心管，加入720µl的75%乙醇及80µl5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；（11）放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；（12）10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800µl75%的乙醇，将DNA再洗30min；南京晓庄学院生物实验教学中心（13）10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（14）加入50µl0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；（15）置于-20℃保存、备用。南京晓庄学院生物实验教学中心称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃)CTAB及β-巯基乙醇保温1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4℃/-20℃保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干用TE溶解DNA,然后低温保存南京晓庄学院生物实验教学中心取提取的DNA溶液2µl(约100-200ng)至一干净的离心管，加入198µl蒸馏水稀释。先200µl蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，然后倒掉蒸馏水，加入200µl已稀释的DNA溶液，测定260nm及280nm的光吸收值（OD260及OD280），计算DNA浓度及OD260/OD280比值。计算公式如下:dsDNA=50×(OD260)×稀释倍数以上浓度单位为g/ml2.DNA浓度的测定南京晓庄学院生物实验教学中心（1）叶片磨得越细越好。（2）移液器的使用。（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。六、注意事项南京晓庄学院生物实验教学中心七、作业(1)本实验所得的植物总DNA制剂中含有哪些遗传物质？(2)在DNA抽提过程中造成DNA分子断裂的主要因素有哪些?(3)本实验中所用到下列试剂的作用各是什么?CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇,EDTA，巯基乙醇