RNA干扰技术原理及应用

RNA干扰的原理及其应用一、RNAi的发现简史90年代初，RichJorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将这种现象命名为共抑制现象(cosuppression),因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称为“quelling”现象。What’smore...1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA(antisenseRNA)去阻断秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis.elegans)的par-1基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA的确能够阻断基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA(senseRNA)作为对照,也同样阻断了基因的表达。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。反义RNA技术反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早是在E.coli的产肠杆菌素的ColE1质粒中发现的，许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。反义RNA技术根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列(Shine-Dalgarnosequence）和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ降解Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。反义RNA技术的原理利用基因重组构建人工表达载体,使其体外或体内表达反义RNA,通过碱基互补与靶RNA配对结合,封闭或抑制靶基因的表达,从而对细胞的功能产生影响这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次将双链dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链ＲＮＡ已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。二、RNAi现象的普遍性随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。三、RNAi的作用机制基因沉默基因沉默分为转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)两种：TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默；对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致;PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。目前普遍认为RNAi、共抑制、quelling均属于PTGS！dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。rRNAi过程的功能单元：siRNAsiRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。19ntduplex2nt3’overhangsRNaseIIIdomainconnectorhelixamino-terminalhelicasedomainPAZdomain一种RNaseIII活性核酸内切酶（Dicer）Argonaute家族的PAZ结构域III型RNA酶活性区域RNA解旋酶活性区dsRNA结合区域第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。在ATP酶的作用下，活化的RISC以单链siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基因的沉默。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。DicerRISC碱基互补酶解第二步第一步RNAi的放大效应机制siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解，生成大量的次级siRNA。形成一种链式反应，使特定的基因表达被阻止。四、RNAi研究的一般技术路线1.基因功能的研究由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势.在线虫的体内外试验及哺乳动物的体外培养的细胞中，RNAi都能达到基因敲除的结果，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。五、RNA干扰的应用2.基因治疗RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA即可以使多个基因同时沉默。基因治疗局限：1.运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈，如何将双链RNA高效特异的转入体内靶细胞仍是一个难题；2.大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后，会非特异的阻断基因的表达治疗肝炎病毒感染JudeLieberman等已经成功地利用RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（FAs）基因”。FAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所导致的。JudeLieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默”FAs基因的siRNA，发现有90％的肝细胞接收到了这种RNA分子，FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受RNAi治疗的实验鼠有40％在３天内死亡。而40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来，10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。3.病毒类疾病的治疗治疗肝炎病毒感染McCaffreA及其导师KayM结果则证明RNAi可以直接治疗肝炎病毒。他们首先将HBV的基因组插入到小鼠肝脏细胞中，模拟HBV感染，然后合成靶向HBV基因组不同部分的2种siRNA并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。结果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒RNA的数量与对照组相比减少了92%。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。但Kay指出，这种运送siRNA方法不能用于人类。他们正在实验更温和的途径将siRNA运送到细胞中。对于人来说，身体比老鼠大得多，血液循环系统也庞大。如果解决了将siRNA有效而又充足地运送到细胞的问题，将为许多疾病和感染提供新疗法。RNAi与其它病毒HuWY等证明了siRNA能阻抑逆转录Rous肉瘤病毒（RSV）感染脊椎动物；Leonid等发现针对脊髓灰质炎病毒中编码衣壳蛋白或编码病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒复制，加速清除受染细胞中的脊髓灰质炎病毒；Jia等发现Rta-siRNA(Rta是疱疹病毒基因表达的一种起始转录因子)和ORF45-siRNA能特异阻止疱疹病毒复制。存在的问题目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍；如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚；目前RNAi机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。siRNA的稳定性在多基因家族中的非特异性问题如何将RNAi技术运用到临床试验THANKYOU！