水通道蛋白1及4在喉癌组织中的分布及意义

，孙丽光2，董震1，杨占泉1，王鑫11吉林大学中日联谊医院，长春（130033）2吉林大学公共卫生学院卫生部放射生物学重点实验室，长春（130021）E-mail：[e-mail]摘要：目的明确水通道蛋白1(aquaporin1,AQP1)及水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)在喉癌组织中的表达和分布，并探讨其在喉癌发病中的意义。方法取喉癌组织20例及癌旁正常组织15例，应用RT-PCR、Westernblot、免疫组织化学技术检测AQP1及AQP4在喉癌和正常对照组织中的表达及分布。结果AQP1主要表达于正常喉粘膜固有层的血管内皮细胞及喉粘膜腺体。大量表达于喉癌组中的血管内皮细胞及部分肿瘤上皮细胞和癌巢中。AQP4主要表达于正常喉粘膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮及固有层粘膜腺体，表达于喉癌组织的肿瘤上皮细胞、癌巢及喉粘膜腺体上。结论AQP1及AQP4分布于喉癌组织的不同部位，协同增加肿瘤上皮和血管对水的通透性运输，从而促进肿瘤的生长及向周围基质浸润。关键词：水通道蛋白；喉肿瘤；通透性水通道蛋白（aquaporin,AQP）是一类对水具有高度选择性的糖蛋白,属古老的主要固有蛋白(majorintrinsicprotein，MIP)家族成员，哺乳动物AQP迄今为止已发现11种(AQP0～AQP10)[1]。大量研究证实，细胞代谢过程中所需要的水主要是通过AQPs对水分子的高度选择性来完成跨膜转运的，许多疾病可能与水通道蛋白功能异常或调节失控有关。近年研究表明多数肿瘤有很高的组织间隙液体压力，其新生血管对血浆蛋白及其他循环体系中的高分子物质具有很高的渗透性[2],这在肿瘤的生长和扩散（侵袭和转移）中有重要作用。本研究应用RT-PCR、Westernblot、免疫组织化学技术检测AQP1及AQP4在喉癌和癌旁正常对照组织中的表达及分布，探讨其在喉癌发病中可能的作用机制及意义。1.材料与方法1.1材料喉癌组织标本20例，来自吉林大学中日联谊医院耳鼻咽喉科2003年9月至2004年6月行喉全切除或喉部分切除的住院患者，其中男14例，女6例，年龄43～69岁。声门上型11例，声门型5例，混合型4例。根据UICC1997年修订的TNM分期标准：II期4例（T2N0M0），III期10例(T3N0M06例，T2N1M04例)，IV期6例（T4N1M04例，T2N2M01例，T3N2MO1例）。全部患者术前均未接受放射治疗及化学治疗。正常对照组织15例来自全喉切除术患者癌旁正常组织。所有喉癌组织和正常对照组织切除后部分组织立即放入液氮中冰冻保存，部分组织经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋，连续切片5µm厚，HE染色后病理证实。1.2检测方法1.2.1逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）取冰冻的喉癌组织和癌旁对照组织，采用TrizolReagent(Invitrogen，USA)提取细胞总RNA。使用前测量RNA的浓度，然后应用逆转录PCR试剂盒（IBM，Canada）进行逆转录合成cDNA第一链。合成后的cDNA进行PCR反应（PrimixTaq,TAKARA，Japan），β-actin作内对照。根据AQP1、AQP4及β-actin基因序列设计引物为：AQP1上游：1本课题得到国家自然科学基金项目资助课题（30371524）和教育部博士点专项科研基金项目（20030183049）的资助。’-GGTGATCACACACAACTTCAG-3’,下游：5’-GTAAATCTTGGTCCCCAGGAA-3’，扩增产物431bp。AQP4上游：5’-TCCCTTTGCTTTGGACTCAG-3’,下游：5’-TTCCCCTTCTTCTCCTCTCC-3’，扩增产物719bp;β-actin上游：5’-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3’，下游：5’-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3’，扩增产物305bp。94℃变性3分，循环次数为30周期，反应条件:94℃30秒、63℃45秒、72℃1分,延伸72℃10分,PCR产物电泳后应用图像分析系统（HPIAS-1000，同济医科大学生产）行图像扫描分析。1.2.2westernblot免疫印记法:将冰冻的肿瘤及喉正常组织剪碎后，用组织蛋白提取液匀浆后，提取膜蛋白，应用蛋白分析试剂（Bio-Rad，USA）测定蛋白浓度,50µg蛋白质溶于蛋白上样缓冲液中煮沸变性3分钟，行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将电泳后的蛋白质转移到硝纤膜上，5%脱脂奶粉封闭后将硝纤膜与稀释为1：100的兔抗AQP1或AQP4多克隆抗体（博士德生物技术公司）在室温下作用,TBST洗膜后再与碱性磷酸酶标记的1：1000山羊抗兔二抗（中山生物试剂公司）作用，洗膜后与BCIP/NBT底物反应，蛋白染色为蓝黑色。染色条带被扫描后测定灰度值,计算每组病人的灰度值(χ±s)，比较两组的差别。1.2.3SP(streptavidinperoxidase)免疫组化染色法：标本以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，做5µm厚的连续切片。石蜡切片梯度酒精脱蜡至水后，3%H2O2孵育10min消除内源性过氧化物酶活性，微波修复抗原10min，滴加非免疫血清，室温孵育20min，倾去血清，滴加1：100的兔抗AQP1或AQP4多克隆抗体（博士德生物技术公司），4°过夜，经0.1mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate-buffersolution,PBS）洗后行免疫组化染色，3，3ˊ-二氨基联苯胺（3，3ˊ-diaminobenzidine,DAB）显色，Mayer苏木素复染，封片。以胞膜或胞浆有棕黄色染色者为阳性细胞。用PBS代替一抗作为阴性对照。正常肾组织作为阳性对照。所有切片在光学显微镜下观察，取染色良好（阳性细胞染色清晰，背景染色很低）的组织切片，在低倍镜下找到阳性细胞较为密集的区域，图像分析系统测量AQP1或AQP4阳性产物面积及阳性产物强度灰度值。然后将上述数值依据赵景民[3]等的方法转化成免疫组化阳性指数,即:免疫组化阳性指数=阳性面积/测量组织面积×阳性强度灰度值。取其平均值作为阳性细胞表达率（χ±s）1.2.4统计学方法:实验数据输入SPSS11.0软件数据库中,应用两样本均数比较的t检验。2.结果2.1RT-PCR:AQP1及AQP4mRNA在喉癌及喉正常组织中均有表达。AQP1与β-actin灰度值相比后统计分析证实AQP1mRNA在喉癌组织中表达较癌旁正常组织表达明显增多（t=2.591,P＜0.05）。AQP4与β-actin灰度值相比后统计分析证实AQP4mRNA在喉癌组织中表达与癌旁正常组织表达无明显差异（t=1.796,P＞0.05）（图1）。2.2westernblot免疫印记法:喉癌及癌旁正常组织内均有AQP1及AQP4蛋白表达，AQP1蛋白条带位置为28kDa,AQP4蛋白条带位置为30kDa。蛋白条带灰度值分析表明：喉癌AQP1蛋白表达量较癌旁正常组织明显增多（t=2.612,P＜0.05）（图2），喉癌AQP4蛋白表达量与癌旁正常组织无显著差异（t=1.939，P＞0.05）（图3）。2.3SP免疫组化染色法：所有切片染色背景清晰，阴性对照不着色。AQP1及AQP4阳性反应呈棕黄色，主要存在于细胞膜及细胞浆。AQP1主要表达于正常喉粘膜固有层的血管内皮细胞、喉粘膜腺体及肌细胞核膜上，以及部分浆细胞，纤维母细胞和淋巴细胞的胞膜及胞浆上，上皮层无表达（图4）。在喉癌组织中，AQP1主要表达于肿瘤的新生血管内皮细胞，部分肿瘤上皮细胞和癌巢内（图5）。且喉癌AQP1表达的阳性指数较癌旁正常组织明显增多，差异有显著性（t=2.923，P0.01）。AQP4主要表达于正常喉粘膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮及固有层粘膜腺体，以及肌细胞膜上（图6）。表达于喉癌组织的肿瘤上皮细胞、癌巢及喉粘膜腺体上（图7）。且喉癌组织AQP4阳性表达的阳性指数较癌旁正常组织无显著性差异（t=1.577，P＞0.05）。3.讨论恶性肿瘤昀基本的生物学特征是瘤组织的无限增殖和瘤细胞的分化异常。为满足快速增殖、分裂和侵袭转移的需要，癌细胞比正常细胞更需要水分子的快速跨膜转运，多数肿瘤有很高的组织间隙液体压力和很高的微血管渗透性。目前大量研究证实AQP在多种肿瘤组织、细胞系及微血管内皮细胞中高度表达，认为AQP可能与肿瘤这种高血管渗透性有很大关系[4～7]。应用AQP蛋白抑制剂后可以显著降低肿瘤的转移[8]，说明AQP有促进肿瘤转移的作用。还有昀新的观点认为AQP具有致癌特性，AQP全长cDNA的异位表达引起许多表现型的改变，包括细胞增殖活性加强，非依赖生长的增殖细胞固定等[9]。因此，研究AQP在肿瘤中的表达和分布具有重要意义。AQP在组织中的分布有一显著特点,即各种AQP有其相对的组织细胞分布谱和细胞表达位置（顶膜或侧基膜），同一脏器可以拥有多种AQP,且同一AQP也可以分布于多种组织细胞中,但在同一细胞定位上,没有两种以上的AQP重叠表达,说明每种AQP具有特殊的地位和作用，可以满足不同组织和细胞的代谢需要[10]。一个部位有多种AQPs分布，可以保证细胞以很少的能量从周围吸收水分，维持细胞正常的代谢以及复制和生存需要。尽管AQP1及AQP4都具有水转运功能，但其在喉部的分布位置及在局部微环境中所起的作用是不同的。本研究证实，AQP1主要表达于正常喉粘膜固有层的血管内皮细胞及喉粘膜腺体上，上皮层无表达。AQP4主要表达于正常喉粘膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮及固有层粘膜腺体上，血管内皮细胞无表达。AQP1表达于喉部血管内皮细胞中，可以使水快速通过毛细血管内皮细胞进入周围的组织液中，满足喉部细胞代谢需要，对维持喉部正常生理功能具有重要作用。AQP4主要表达于喉粘膜上皮细胞膜上，这对于喉部粘液正常分泌，维持气道湿度具有重要意义。本研究证实AQP1大量表达于喉癌组织中的肿瘤血管内皮细胞中，其mRNA和蛋白表达量较癌旁正常组织明显增多，证实AQP1可以使肿瘤血管渗透性增加，促进水在肿瘤细胞间的快速转运，促进肿瘤血管生成。AQP4大量表达于肿瘤细胞膜，其表达位置较AQP1明显不同，或许能够改变肿瘤上皮内的渗透压，有助于肿瘤细胞体积及外形的改变，向周围基质浸润。在喉癌组织中有多种AQP分布，可以保证肿瘤细胞以很少的能量从周围吸收水分，保证肿瘤的快速生长，促进肿瘤生长和转移，但其具体机制还有待于进一步研究。:molecularmechanismsforhumandiseases.FEBSLett.2003Nov27;555(1):72-78.2.FolkmanJ.Angiogenesisincancer,vascular,rheumatoidandotherdisease.NatMed，1995，1:27-313.赵景民,翟为溶,张月娥,等.肝细胞癌整合蛋白α5β1、纤维连接蛋白及其降解片段的表达.中华病理学杂志,1997,26（2）：65-69.4.YangB,FolkessonHG,YangJ,etal.Reducedosmoticwaterpermeabilityoftheperitonealbarrierinaquaporin-1knockoutmice.AmJPhysiol，1999，276(1):76-815.WolfMB,WatsonPD.Measurementofosmoticreflectioncoefficientforsmallmoleculesincathindlimbs.AmJPhysiol，1989，256:H282-2906.MichelCC