猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

中国农业科学2009,42(1):267-273ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.01.034收稿日期：2008-02-28；接受日期：2008-05-13基金项目：国家自然科学基金（30571300），中国农业科学院北京畜牧兽医研究所“家畜种质资源研究和创新”科技创新团队资助作者简介：张兴举（1980－），男，河北巨鹿人，硕士研究生，研究方向为动物分子生物学。E-mail：[e-mail]。通信作者李奎（1963－），男，河北松滋人，教授，博士，研究方向为动物遗传育种与繁殖。Tel：[phone]；Fax：[phone]；E-mail：[e-mail]猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析张兴举，唐中林，王志伟，杨述林，牟玉莲，崔文涛，马月辉，储明星，李奎（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/中国农业科学院家养动物遗传资源与种质创新重点开放实验室，北京100193）摘要：【目的】通过对猪TAF7基因初步的研究，为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息，为猪的遗传育种提供分子标记。【方法】以五指山猪为研究对象，克隆TAF7基因，分析该基因结构特点，然后利用IMpRH（theINRA-UniversityofMinnesotaporcineradiationhybrid，法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板）分析该基因在猪染色体上定位信息，利用半定量RT-PCR方法，分析该基因在成年五指山猪16个不同组织（心脏、背肌、淋巴、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、子宫、睾丸、胃、小肠、大肠、卵巢、胸腺、脑、脂肪）的表达谱信息。【结果】克隆得到长1701bp的五指山猪TAF7基因序列，其中包括1050bp完整CDS（CodingSequence，编码序列）区域，分析表明其编码含349个氨基酸的蛋白质。利用IMpRH分析结果表明，猪TAF7基因与分子标记SW1879和IL4（interleukin-4，白细胞介素-4）紧密连锁，LOD（LimitofDetection，检测极限）值分别为6.69和6.15。组织表达谱分析结果显示该基因在大多数组织中均有表达，其中在睾丸表达量较高，而在心脏、背肌中表达很低。【结论】猪TAF7基因5’UTR中有一个短的内含子，而在该基因CDS区域没有内含子。猪TAF7蛋白序列与人TAF7蛋白序列的相似性较高，二者在生物系统发育树中的距离最接近。猪TAF7基因在大多数组织中均表达，在猪睾丸中表达量较高，证实它调节目的基因转录具有广泛性。关键词：猪TAF7基因；克隆；基因定位；组织表达谱Cloning,MappingandTissueExpressionProfileofPorcineTAF7GeneZHANGXing-ju,TANGZhong-lin,WANGZhi-wei,YANGShu-lin,MUYu-lian,CUIWen-tao,MAYue-hui,CHUMing-xing,LIKui(TheKeyLaboratoryofDomesticAnimalGeneticResourcesandGermplasmInnovationofCAAS,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193)Abstract:【Objective】TheobjectiveistoilluminatethemolecularfeaturesandtheexpressionprofileoftheporcineTAF7(TBP-associatedfactor;TBPisaTATA-bindingprotein)gene.Asonecomponentofthetranscriptionalpre-initiationcomplex,theproteinTAF7playsanimportantroleduringregulationofthegeneexpression.【Method】TheporcineTAF7genefromtheWuzhishanpigsamplewasclonedandsequenced,andthenitsmolecularfeatureswereanalyzed.MappingoftheporcineTAF7genetoporcinechromosomewasmadewiththeIMpRHpanel.ThemRNAdistributionprofileoftheporcineTAF7geneinsixteenadultWuzhishanpigtissues(heart,dorsalmuscles,lymphnodes,spleen,liver,kidney,lung,uterus,testicle,stomach,smallandlargeintestine,ovaries,thymusgland,brainandfat)wereexaminedbysemi-quantitativeRT-PCR.【Result】Asequencewithalengthof1701bpwascloned,itcontainedtheCDS(codingsequence)regionof1050bpoftheporcineTAF7gene.AnalysisofthenetworksoftwareGENSCANshowedthattheporcineTAF7geneencodedaproteincomposedof349AAs.BytheIMpRH(theINRA-UniversityofMinnesotaporcineradiationhybrid)panel,porcineTAF7genewasassignedtoporcinechromosome2,associatedwithSW1879andIL4(interleukin-4)closely,theLODs(LimitofDetection)were6.69and6.15,respectively.ThemRNAdistributionoftheporcineTAF7genewasthatitwasexpressedalmostinalltissues,especiallyhighlyexpressedintesticleandcouldhardlybeexaminedinheartanddorsalmuscles.【Conclusion】TheporcineTAF7genehasansmallintroninthe5’UTR,butthe268中国农业科学42卷CDSisintronless.ThesequenceoftheporcineproteinTAF7shareshighsimilaritywithitshomologfromhuman,andtheybothareclosedinthePhylogenetictree.TheporcineTAF7genecanbedetectedalmostinalltissues,whichshowsusitsextensivefunctionsfortranscription.Furthermore,thephenomenonofhighlyexpressedintesticleneedsfurtherresearch.Keywords:porcineTAF7gene;cloning;mapping;expressionprofile0引言【研究意义】TAF7蛋白是很多基因转录的初始转录复合物成分之一，它在基因表达调控中起到非常重要的作用，克隆猪TAF7基因，明确在染色体上的精细定位及其遗传连锁的分子标记，对猪遗传学研究和猪分子育种学研究具有重要意义。【前人研究进展】TFⅡD（transcriptionfactorDⅡ，转录因子DⅡ）在真核生物基因转录的启动过程中起到中枢性作用[1]。TFDⅡ复合物由TBP（TATA-bindingprotein，TATA框结合蛋白）与TRF（TBP-relatedfactor，TBP关联蛋白）和TAFs（TBP-associatedfactors，TBP相关蛋白）组成[2-6]，这3类转录因子均具备各自独特的生物学功能，其中TAF是一个具备转录起始识别和调控的独立的蛋白家族。近年来，越来越多的TAF家族成员被鉴定出来，研究发现TAF家族成员在氨基酸序列上具有很高的相似性，而且每一个成员之间在不同物种间具有较高的保守性[7]。在TFDⅡ复合物中，TAF1作为“支架”蛋白同时具有DNA和其它转录因子结合的活性，普遍存在于转录起始复合物中。TAF7被称为转录起始复合物中的抑制因子，它直接与TAF1的乙酰转移酶（AT）亚基结合，通过抑制TAF1的乙酰基转移酶活性而达到抑制基因表达、调节基因转录的功能[8]。近年来，关于TAF7蛋白的功能及其分子作用机制的研究越来越多。一般认为，TAF通过两条途径调控各种生物学现象，一是与其它共激活因子互作，以共同调控目的基因的转录；二是直接结合启动子元件，以控制目的基因的转录。Lavigne研究发现，维生素D3、甲状腺激素受体和视黄醇类X受体衍生物均可与TAF7蛋白互作，促使TAF7转录活性提高5倍[9]；c-Jun作为TAF7的共激活因子，通过与TAF7结合改变TAF7结构来调节某些基因的表达，达到对细胞信号应答的目的[10]。在精子发生过程中，从精母细胞发育到粗线期开始，TAF7从TFDⅡ复合物中脱离并在细胞核内逐渐消失，TAF1的乙酰基转移酶活性恢复，同时TAF7L因子取代TAF7的位置，TAF7L与TBP和TAF家族成员结合并负责精子发生过程中一系列蛋白的转录[11-12]。【本研究切入点】TAF7作为基因转录起始因子之一，在基因表达调控中发挥广泛的、重要的生物学作用。目前已克隆了酵母、果蝇、人、鼠、牛等11个物种的TAF7基因，对其功能也有了一定的了解。但对于TAF7蛋白的生物学作用未了解透彻，需要进一步研究，而且未见有关猪TAF7基因的研究报道，因此，本试验以五指山猪为研究对象，开展猪TAF7基因的初步研究。【拟解决的关键问题】克隆猪TAF7基因，确定该基因在猪染色体上的精细定位，分析其遗传连锁信息，分析该基因在成年五指山猪16个组织中的表达情况。1材料与方法1.1基因克隆本试验所用30个DNA样品分别来自五指山小型猪、巴马小型猪、贵州小型猪、莱芜猪、通城猪和长白猪耳组织，每种猪采5个个体的样品。本试验使用五指山猪睾丸组织cDNA样品，RNA提取按照Trizol试剂盒（LifeTechnologies，GrandIsland，NE，USA）操作说明进行，经RT-PCR获得cDNA，置于－20℃保存。根据NCBI网站数据库中提供的人TAF7基因序列钓取猪EST，将所得猪EST经DNAStar软件拼接得到contig序列，按照此contig序列利用PrimerPremier5.0设计PCR引物，引物信息见表1。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TianGen）回收纯化PCR扩增产物，将目的片段与pGEM-Teasy载体连接，16℃连接6h。然后把连接产物转入DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆。经PCR检测后，将阳性菌液并送至北京英俊生物技术公司测序。1.2染色体定位利用法国农业科学院明尼苏达大学提供的辐射杂种克隆板（含118个杂种细胞系DNA模版）对猪TAF7基因进行染色体定位。然而，应用辐射杂种克隆板对染色体进行精细定位对于PCR引物的要求比较高，本试验中设计的引物（TMSF/TMSR）如表所示。确定使用该引物扩增在猪模板中呈阳性，而在仓鼠模板中呈阴性。同时，PCR产物片段具有如下特点：（1）1期张兴举等：猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析269表猪T