第12章免疫组织化学技术

1安徽理工大学医学院SchoolofMedicine《临床免疫学与免疫学检验》教案首页第次课授课时间教案完成时间课程名称临床免疫学与免疫学检验年级专业、层次医学检验本科教师张荣波专业技术职务授课方式（大、小）大班学时2学时授课题目（章、节）第十二章免疫组织化学技术基本教材或主要参考书王兰兰主编《临床免疫学与免疫学检验》（第三版，人民卫生出版社）教学目的和要求：1、掌握免疫组织化学技术要点2、掌握酶免疫组织化学技术大体内容与时间安排，教学方法：课堂讲授辅以启发式提问，配以多媒体投影1、免疫组织化学技术要点（0.6学时）；2、酶免疫化学技术（1学时）；3、荧光免疫组织化学等（0.4学时）。教学重点、难点：重点：1、免疫组织化学技术要点2、酶免疫组织化学技术分类及应用难点：1、免疫组织化学技术要点2、酶免疫组织化学技术分类及应用教研室审阅意见：________________（教学组长签名）________________（教研室主任签名）2006年月日2（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配第十二章免疫组织化学技术第一节免疫组织化学技术要点免疫组织化学技术中根据标记物的不同,免疫细胞组织化学技术可分为酶免疫组织化学技术、荧光免疫组织化学技术、亲和免疫细胞组织化学技术、免疫金(银)细胞染色组织化学技术、免疫标记电镜技术和杂交免疫细胞组织化学技术等。免疫组织化学的全过程实验步骤①抗原的提取与纯化②免疫动物或细胞融合,制备特异性抗体及纯化③标记物与抗体结合形成标记抗体④标本的处理⑤抗原抗体反应和呈色反应⑥显微镜下观察结果第二节酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术(enzyme－immunohistochemisty－technique,EIHCT)是利用酶标记已知抗体(或抗原),然后与组织标本中相应抗原(或抗体)在一定条件下相互结合形成带酶分子的复合物,酶遇到底物时,能催化底物水解,或氧化或还原,产生有色的不溶性产物,出现显色反应,在显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观察分析。最常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)及葡萄糖氧化酶(GOD)等。酶免疫组织化学技术分为酶标记法和非标记抗体酶技术(一)直接染色法(一步法)用酶标抗体直接与处理过的组织标本中相应抗原反应,继用底物二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)和H202进行显色,产生的有色物质沉积在抗原抗体反应部位,从而对组织或细胞抗原定位、定性和定量。(1)标本处理(2)用正常血清或牛血清白蛋白(bovine－semm－albumin,BSA)溶液处理,以封闭非特异性结合点。(3)加酶标抗体(4)加入底物,普通光学显微镜下观察显色结果。(二)间接染色法(二步法)先用未标记的已知抗体与标本中相应抗原反应,再用酶标抗抗体与之反应,形成抗原－抗体－酶标抗抗体复合物,加底物显色。0.6学时1学时3（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配第三节荧光免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术是采用荧光素标记已知抗体(或抗原)作为探针,检测组织与细胞标本中的靶抗原(或抗体)。直接法是将荧光素标记的已知抗体(或抗原)与切片(印片)中相应的抗原(或抗体)直接发生反应。间接法是荧光素标记抗体不与切片中的抗原直接发生反应,而在其间增加一次或多次无标记的抗原抗体反应。第四节免疫金（银）组织化学技术胶体金(colloidal－gold)是氯金酸(chloroauric－acid)的水溶液,能与多种生物大分子结合,已成为免疫标记技术中较常应用的一种非放射性示踪物。免疫胶体金标记原理：胶体金颗粒标记蛋白质(抗原、抗体或酶)的原理是金颗粒表面负电荷与蛋白质正电荷之间非共价键的静电引力相互吸引,当达到范登华引力半径范围之内时,蛋白质与金颗粒表面形成牢固结合免疫胶体金标记物制备特点：化学法制备胶体金最常用的方法为还原四氯金酸法。四氯金酸（HAuCl4）是一种高亲水性结晶物,在还原剂,如白磷、枸橼酸三钠等的作用下,还原成胶体金。不同大小的胶体金颗粒有不同的适用范围:5nm以下颗粒适用于标记抗原或组织化学法检测；5-2Onm的颗粒适用于液相免疫检测；而2Onm以上的颗粒多用于免疫沉淀试验。免疫金（银）组织化学染色法：免疫金(银)组化染色技术是金颗粒标记的抗原(抗体)与相应的抗体(抗原)特异性结合后,在银显色剂的作用下,标记物上的金颗粒起液化作用,使显影液中的硝酸银离子还原成银原子沉淀,在抗原抗体复合物的金颗粒周围形成一个逐步增大的黑色银壳,由于金颗粒的液化作用,更多的银离子被还原,最后使抗原位置放大,从而提高镜下的可见度。第七节免疫组织化学技术的应用：荧光免疫组织化学技术：主要用于病原体感染的早期诊断,自身抗体检测,分析淋巴细胞表面标记物质及抗原、抗体的免疫组化定位等。酶免疫组织化学技术：酶免疫组织化学技术主要用于组织切片或其他抗原的定位检测。0.4学时4（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配5免疫标记电镜技术：对组织细胞中的抗原或抗体成分,如病毒和细胞表面抗原等可进行准确的定位检测。激光扫描共聚焦显微镜技术：只要能用荧光探针进行标记就可用于形态观察和定位、定量分析,可广泛应用于细胞形态学、细胞生理学、分子生物学等领域的研究。（教案末页）6小结免疫组织化学技术中根据标记物的不同,免疫细胞组织化学技术可分为酶免疫组织化学技术、荧光免疫组织化学技术、亲和免疫细胞组织化学技术、免疫金(银)细胞染色组织化学技术、免疫标记电镜技术和杂交免疫细胞组织化学技术等。1941年Cons等首次用荧光素标记肺炎双球菌粘多糖抗体，检测小鼠肺组织内肺炎双球菌，开创了免疫组织化学的新技术。20世纪60年代，Nakane建立了酶标记抗体的技术，70年代Sternberger在此基础上改良并建立了过氧化物酶－抗过氧化物酶（PAP）技术，使免疫组化技术得到进一步广泛应用。近几年来，随杂交瘤技术及杂交瘤技术及单克隆抗体技术的发展，使之辈的诊断用抗体具有更高的特异性和敏感性。免疫组化技术借助这些新技术的发展，在临床病理学、免疫学、微生物学诊断中发挥了巨大的实用价值。目前，免疫住址化学技术正进一步向着分子与基因水平发展。复习思考题，作业题1、免疫组织化学的全过程包括哪些步骤；2、简述荧光免疫组化技术直接法的原理；3、试述酶免疫组化技术的原理及特点。情况反映及分析1授课内容熟练，条例清楚，重点突出。2授课时结合典型病例，吸引学生们得注意力，提高学生的兴趣，加深印象。3按时完成教学任务，收到学生好评。4多媒体教学以其新颖、直观、内容丰富及灵活的特点深受学生欢迎，教学效果良好。5课堂手法演示很重要，为学生在课后的互练中打下良好基础。6由于课堂时间较短，因此教学中务必做到重点突出，层次分明，讲解生动明了。