第一章组织培养技术的基本理论知识

组织细胞培养技术主讲：周晓霞第一章细胞培养的基本理论知识组织培养工作开始于20世纪初，Harrison(1907)最早对两栖类胚胎的神经管组织进行了悬滴培养-哈里森悬滴培养法真正开创大规模细胞培养工作是在20世纪40年代，W.Earle和R.Dulbecco设计出了细胞培养液配方，并开始了单细胞的悬液培养，细胞培养工作才得到广泛发展。细胞培养始传我国是20世纪30年代。至50年代以后，组织培养已在我国逐步开展起来组织细胞培养的诞生和发展简史第一节细胞培养基本概念一、细胞培养(cellculture)基本概念：细胞培养是指从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。体外培养细胞培养（InVitro）组织培养器官培养不分细胞培养(Cellculture)：细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长。组织培养（TissueCulture）其本意是指从体内取出组织，摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。注：组织培养和细胞培养并无严格区别！器官培养（QrganCulture）,指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用。多莉克隆猴单克隆抗体制备过程优点：1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动等二、细胞培养的优点与缺点2.可控制：选择对象：均一性、重复性哪一种：类型：上皮？间质？性质：正常？肿瘤？阶段：调节条件：物理、化学、生物等因素可控研究方法：可采用各种研究技术、记录方法3.应用广：学科多，对象广。4.较经济：可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象缺点：虽然现在人工模拟体内环境的技术已经很高,但人工所模拟的条件与体内实际仍不完全相同。当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中久了，必然发生变化。１.与体内主要不同相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。2.主要表现失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，细胞趋向单一化；3.提示要正确认识体外培养细胞：是一种特定条件下生长的细胞群体。第二节培养物的生长生物学一、体外培养细胞的生长类型按生长方式分为二型粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。粘附型细胞：粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长。细胞在体内、外的粘附方式存在差异：体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同按照培养细胞的主要形态，可分为以下类型：(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞1234上皮样细胞型名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于来源：来源于外胚层，内胚层细胞（个别例外）如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡，上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺路石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动成纤维细胞样细胞名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核生长特点排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(Kupffercell)以及某些肿瘤细胞等。多形型细胞多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，但它不像成纤维细胞型的细胞那样，不规则形态由宽扁的胞质突起所致。其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞。注意：细胞形态并非固定不变，可随培养条件、生长时期、细胞数量等而变化细胞形态只是对培养物判断或识别的参考指标若要确定某一培养物的确切细胞类型，必须借助更为特异的鉴定方法，如进行组织化学或免疫细胞化学染色鉴定。培养细胞形态不稳定血清Hela高血清低血清成纤维细胞样上皮样细胞pHHela太酸或太碱标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度3T3低密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变悬浮或贴附悬浮贴附圆形成纤维或上皮样转化与否未转化转化后成纤维样可成上皮样悬浮生长型概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源来自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞也可能特点在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点生存空间大，提供数量大传代方便(不需消化)易于收获缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)小结：体外培养细胞的生长类型粘附型细胞悬浮型细胞：血细胞以及某些肿瘤细胞上皮型细胞成纤维型细胞游走型细胞多形型细胞培养细胞分化状态的变化分化特征逐渐减弱，原本各种各样的分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性，这种现象被称为去分化或脱分化培养细胞的增殖能力分裂增殖和生长发育是体外培养细胞的两大生命特征;增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。二、培养细胞的生长和增殖过程１）单个细胞的生长过程：ＤＮＡ合成细胞分裂复习：细胞周期＝Ｇ１＋Ｓ＋Ｇ２＋Ｍ２）培养细胞的生长过程原代培养期传代期衰退期细胞周期(Cellcycle)：指细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的过程。常分为4个时期，即DNA合成期（S期）、有丝分裂期（M期）、有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期（G1期）以有DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期（G2期）。若某种原因（如乏氧、血清饥饿等）细胞不再沿细胞周期运行，而进入休眠状态，则称为G0期。体外培养细胞的整个生命活动过程分期原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中继续培养的过程。原代培养传代培养选取生长良好的细胞加入胰蛋白酶消化液镜下观察倒去酶液，加入培养液反复吹打制成细胞悬液按比例分装后培养2)每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）1.游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时2.贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等3.潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。4.对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。5.停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度限制每一代细胞的生长过程分期第三节培养细胞的生存环境与条件１．细胞的营养需要：１）基本营养物质：氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）维生素葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子等２）促细胞生长因子：多由血清提供２．细胞的生存环境１）温度条件对细胞生长的影响不同生物来源的组织细胞培养温度不同；体外培养动物细胞最常用的温度是37℃。耐低温不耐高温！在生理温度范围内，温度与细胞生长率之间存在正相关关系。（复习：温度对酶促反应的影响）２）气相环境对细胞生长的影响动物细胞培养的气相环境都是采用5%CO2与95%空气（提供氧）的混合气体。Ｏ2参与细胞的能量代谢过程。ＣＯ2用于维持培养液的酸碱度。一般多为开放式培养３）培养液的酸碱度对细胞生长的影响大多数的有机体细胞能在pH6.0～8.0的环境中生存。最适宜的pH值范围是7.2～7.4。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力４）无污染、无毒（前提条件！）组织培养常用术语Cellculture(细胞培养)：细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长，称为细胞培养。在细胞培养中，细胞不再形成组织，但在实验室口语中，人们常将它扩展至组织培养与器官培养。贴壁依赖性：为细胞需贴附于底物或支撑物上才能生长的性质。Primaryculture(原代培养)：从体内取出细胞或组织的第一次培养Passage(传代或传代培养)将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。Suspensionculture（悬浮培养）细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式。Cellfusion（细胞融合）在体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使两个独立的细胞融合成一个细胞。Confluent(汇合)：细胞相互连接成片占据所有底物面积。切勿与细胞融合相混淆。Sub-confluent（近汇合）：细胞在底物上生长接近，但尚未完全汇合。Cellline（细胞系）原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。如果不能继续传代或传代数有限,可称为有限细胞系，如可连续传代，则可称为连续细胞系。Clone(克隆)：单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，它们的遗传特性相同。Cellstrain(细胞株):从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。Cellgenerationtime(细胞一代时间)单个细胞两次连续分裂的时间间隔。populationdoublingtime（群体倍增时间）:在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需的时间。