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第8讲植物组织器官培养第8讲植物组织器官培养制备代谢产物制备代谢产物一本节主要内容毛状根培养制备次级代谢产物二本节关键问题1.毛状根的诱导机制与方法、应用2毛状根培养制备次级代谢产物的影响因素2.毛状根培养制备次级代谢产物的影响因素3.植物组织器官、细胞培养制备次级代谢产物的各自优缺点一分化与次级代谢产物关系1细胞分化与次生代谢产物1.细胞分化与次生代谢产物细胞分化程度的提高与次生代谢产物含量有定的相关性例如有一定的相关性。例如:许多植物次生代谢产物的合成与叶绿体的许多植物次生代谢产物的合成与叶绿体的分化有关。2.细胞聚集和组织水平上的分化在聚集的细胞团块中,位于表面和中央的细胞处于不同的分化状态从而常表现出细胞处于不同的分化状态,从而常表现出与游离细胞不同的次生代谢能力。例如:小果咖啡培养物中嘌呤环生物碱的合成取决于细胞团块的大小因此固定合成取决于细胞团块的大小。因此,固定化培养利于提高生产次生代谢产物含量。3.器官水平上的分化有些植物的某种次生代谢产物在某个器官中含量较高,在悬浮培养细胞中含量较低或没有。例如:柴胡根中含有效成分柴胡皂苷,其愈伤组例如:柴胡根中含有效成分柴胡皂苷,其愈伤组织一般不能合成这类化合物。有些植物的培养物在合成次级代谢产物时要求有芽的形成。例如:长春花的脱分化培养细胞中很难获得具有例如:长春花的脱分化培养细胞中很难获得具有抗癌活性的长春花碱,而在培养的长春花簇芽中能测定出长春花碱能测定出长春花碱。大多数植物次级代谢产物与细胞分化有关。离体培养的植物细胞存在不稳定、目标产物含量低需要激素等不足低、需要激素等不足。因此,分化程度较高、遗传更稳定的植物组织器官培养在有价值次级代谢产物生产上展现了应用官培养在有价值次级代谢产物生产上展现了应用潜力。二植物组织器官培养二植物组织器官培养生产次级代谢产物(一)毛状根培养生产次级代谢产物一些植物的次级代谢产物在根里大量合成,但是正常根的培养非常困难,生长缓慢收获困难,收获困难。毛状根(hairyroots)是发根农杆菌(毛状根(hairyroots)是发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)感染双子叶植物后,形成的类似头发一样的根组织。许多植物的毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力产物产量较出次生代谢产物的合成能力,产物产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高。因此Ri质粒可应用于有价值的次生代谢产物的生产产。1.毛状根产生机制发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)是一种革(gg)兰氏阴性菌,能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物,诱发被感染植物单子叶植物及个别的裸子植物,诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根性是因为它具发根农杆菌之所以具有这种致根性,是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri(Rootinducing)质粒。发根农杆菌Ri质粒有几种不同的类型,分别是农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。其中含有农杆碱碱甘露碱黄碱其含有农碱型Ri质粒的菌株通常具有更广泛的宿主范围和更强的致根特性。强的致根特性。Ri质粒(约250kb的大质粒)是位于发根农杆菌染色)是位于发根农杆菌染色体之外的独立的双链环状DNA具有2个主要的功能DNA。具有2个主要的功能区:T-DNA区(TransferredDNAregion转移区)和DNAregion,转移区)和Vir区(Virulaneeregion致病区),致病区)。当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的TDNA可以转化Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中中。在通常状态下,Ri质粒上Vir区的基因处于抑制状态,当发根农杆菌感染寄主植物时,受损伤的植物细胞合成的低分子苯酚化合物乙酰丁香酮使Vir区处于抑制状态的基因被激活,产生一系列限制性核酸内切酶,在酶的切割作用下产生T-DNA链,T-DNA进入植物细胞核内,整合进植物胞基整合表结进植物细胞的基因组。其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。T-DNA上有生长素合成基因tms1和tms2,指导IAA(吲哚乙酸)的合成,因此转化产生的毛状根,在培养时不需要添加外源生长激素,为激养素自养型。2.毛状根诱导方法(1)外植体接种法(1)外植体接种法取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体,与发根农杆菌共同培养2~3天,将植物的外植体移到根农杆菌共同培养23天,将植物的外植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培养,经过多次继代培养转化的植物细胞产生愈伤组织并可继代培养,转化的植物细胞产生愈伤组织,并可产生毛状根。(2)茎杆接种法无菌植株生长到一定时候,将植株的茎尖、叶片切去,剩下茎杆和根部,在茎杆上划出伤口,将带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部切口处,经过一段时间培养,在接种部位产生毛状根状根。(3)原生质体—农杆菌共培养法将原生质体培养3-5天后,加入带Ri质粒的发根农杆菌进行共培养,然后借助于转化后的细胞激素自养型特性或T-DNA上的抗菌素标记筛选出转化自养型特性或TDNA上的抗菌素标记筛选出转化成功的细胞。分裂形成愈伤组织,在无激素培养基上可产生毛状根。3.毛状根培养优点由Ri质粒转化的毛状根生长快激素自养型生由Ri质粒转化的毛状根生长快、激素自养型、生长周期短,在培养时不需要添加外源激素,易于培养。培养。毛状根分化程度高,产生次级代谢产物能力强,毛状根分化程度高,产生次级代谢产物能力强,合成较为稳定,能大量合成某些悬浮培养的细胞不能或者很少合成的次级代谢产物。通过T-DNA改造,易于采用基因工程途径提高次级代谢产物产量级代谢产物产量。4.毛状根在药用次生代谢产物中的应用毛状根应用于药用植物次生代谢产物的生产已有近30年的历史。黄酮类(flavonoids):付春祥等的研究表明。来源于新疆雪莲根段外植体的毛状根系其20d的源于新疆雪莲根段外植体的毛状根系。其20d的生长速率可达到鲜重接种量的24倍。其中黄酮含量是野生雪莲根的86倍是野生雪莲叶片的29量是野生雪莲根的8.6倍,是野生雪莲叶片的2.9倍。生物碱类(alkaloids):孙敏等以长春花(Catharanthusroseus)无菌苗叶片为外植体诱导毛状根,其中长春碱含量是原植物根和叶中含量毛状根,其中长春碱含量是原植物根和叶中含量的27.4倍和23.5倍。长春新碱的含量是原植物根是235倍是23.5倍。蒽醌类(anthraquinones):对何首乌(Polygonium究表multiflorumThunb)的研究表明:以再生植株的叶柄、茎段和叶片为外植体可诱导毛状根,毛状根中大黄酸的含量为2.49μg/L(干重)。是无菌幼苗的2.85倍。苗的倍皂苷类(saponins):对人参的研究表明:以无菌(p)苗带叶幼茎为外植体诱导的毛状根中人参总皂苷含量为2.486%(干重)。高于原药材总皂苷含量含量为2.486%(干重)。高于原药材总皂苷含量1.403%(干重)。苯丙素类(hIid)雪莲毛状根中丁香苯丙素类(phenyIpropanoids):雪莲毛状根中丁香苷和高车前素的含量分别约是野生植株的40倍和倍3倍。萜类(terpenoids):对短叶红豆杉的研究表明:以萜类(p)对短叶红豆杉的研究表明以无菌苗的芽为外植体可诱导出毛状根。毛状根中紫杉醇的含量为愈伤组织的13--80倍。紫杉醇的含量为愈伤组织的1.38.0倍。(二)冠瘿组织培养生产次级代谢产物()冠瘿组培养生产次级代谢产物冠瘿组织(Crowngall冠瘿组织(Crowngalltissue)是由根癌农杆菌(Abti(Agrobacteriumtumefaciens)感染引起的植物肿瘤它能在外加物肿瘤组织,它能在无外加植物激素的培养基上生长。冠瘿组织形成与根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)上的Ti质粒有关Ti质粒上也有段特殊的TDNA的Ti质粒有关。Ti质粒上也有一段特殊的T-DNA,编码细胞分裂素合成酶基因ipt(trnsr)以及生长素合成酶基因()()素合成酶基因iaaM(trns1)、iaaH(trns2)。根癌农杆菌诱导植物形成冠瘿组织的过程与发根农杆菌诱导植物形成毛状根的过程相似。T-DNA整合进植物细胞基因组后,生长素合成整合进植物细胞基因组后,生长素合成酶基因iaaM(trns1)、iaaH(trns2)分别表达色氨酸单加氧酶吲哚乙酸酰胺水解酶,两者共同酸单加氧酶、吲哚乙酸酰胺水解酶,两者共同作用合成生长素吲哚-乙酸(IAA)。细胞分裂素合成酶基因i()表达异戊烯基细胞分裂素合成酶基因ipt(trnsr)表达异戊烯基转移酶,催化合成分裂素2-异戊烯基腺嘌呤(ZIP)。T-DNA指导的生长素与分裂素的合成导致了转TDNA指导的生长素与分裂素的合成导致了转化植物形成冠瘿组织。冠瘿组织培养不仅可以生产植物根中产生的次级代谢产物,而且可以制备植物叶中的代谢产物,国外利用冠瘿组织培养制备了喹啉生物碱我国也已经喹啉生物碱,我国也已经开展西洋参冠瘿组织培养制备人参皂苷的研究制备人参皂苷的研究。粒个构Ti质粒另外一个应用:构建转基因植物三毛状根培养生产药用次级代谢产物的讨论分析1.长春花碱毛状根培养制备长春花(Catharanthusroseus(L.)Don):夹竹桃科长春花属。竹桃科长春花属。长春花姿态优美,花期长,适合布置花坛、花境,也可作盆栽观赏。还是一种防治癌症的药境,也可作盆栽观赏。还是种防治癌症的药源植物。长春花中含55种生物碱。其中长春碱和长春新碱对治疗绒癌等恶性神瘤、淋巴肉瘤和长春新碱对治疗绒癌等恶性神瘤、淋巴肉瘤及儿童急性白血病等都有一定疗效(长春新碱抗癌比长春碱高强)。2.雪莲花毛状根培养制备黄酮发根农杆菌R1601诱导水母雪莲叶片21d时达到最大值,为633mg/L氮源总浓度为30mmo1/L时,毛状根生长量和总黄酮合成量均达到最大生长量和总黄酮合成量均达到最大,分别为7.3g/L(DW)和617mg/L;NH+/N0为525时状根长NH4+/N03-比例为5:25时,毛状根生长量和总黄酮合成量均达到最大,分别为8.0g/L(DW)和821mg/L50mg/L葡萄糖效果最好,毛状根干重和总黄酮合成量分别达到7.6g/L(DW)和773mg/L;20mg/L蔗糖和30mg/L葡萄糖组20mg/L蔗糖和30mg/L葡萄糖组合时,毛状根生长量达到7.6g/L(DW),总黄酮合成量达到850mg/L850mg/LNOTE:G:葡萄糖;S:蔗糖GA3(赤霉素)对水母雪莲毛状根侧根的产生有强烈促进作用,GA3浓度为05mg/L时毛状根生长量达到0.5mg/L时,毛状根生长量达到9.1g/L(DW),是基本培养条件下的1.2倍;总黄酮合成量达到936mg/L。g0.5mg/LGA3和0.5mg/LIBA(3-吲哚丁酸)组合对毛状根生长和总黄酮合成酸)组合对毛状根生长和总黄酮合成最有利,生长量为12.6g/L(DW),比基本培养条件时提高了70%;总黄酮合成量为1287mg/L。NOTE:NAA(萘乙酸);IBA(3-吲哚丁NOTE:NAA(萘乙酸);IBA(3吲哚丁酸);IAA(吲哚乙酸);BA(6-苄氨基嘌呤)结论上节例子反应器悬浮培养细胞:3.0%黄酮3.讨论现状:目前转化成功毛状根的植物有200多种,如使其模化生产有次生代产但如何使其规模化生产有用的次生代谢产物报道较少。课堂讨论题:你认为植物毛状根培养的最大限制或问你认为植物毛状根培养的最大限制或问题在哪里?毛状根生产次级代谢产物的影响因素当前制约毛状根在药用植物有效成分生产中应用前制约在药用植物有效成应用的主要因素:毛状根诱导率毛状根发酵培养技术些物理因素(如光强温毛状根发酵培养技术:一些物理因素(如光强、温度)和化学因素(如培养基、碳源、氮源、激素、前体诱导子等)均会对毛状根的增殖和次生代谢前体、诱导子等)均会对毛状根的增殖和次生代谢物质的合成产生影响。生物
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