茶多酚干预乳腺癌组织及重要器官血管生成相关因子表达研究

-1-茶多酚干预乳腺癌组织及重要器官血管生成相关因子表达研究*张燕明陈信义**徐力北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京：100700北京市重点研究室（中医内科学），北京：100700南京中医药大学科研处，南京：210029Email：[e-mail]摘要：目的观察茶多酚对移植性小鼠乳腺癌（EMT6）组织与重要脏器（心、脑、肾）组织血管生成相关因子表达影响。方法应用小鼠可移植性乳腺癌EMT6细胞株，经培养传代后，以纯系BALB/c小鼠为荷瘤动物进行移植，并采用茶多酚灌胃及局部注射两种干预措施，以免疫组化方法检测小鼠乳腺癌组织VEGF、bFGF、TIMP-2表达，并测定心、脑、肾组织中VEGF及TIMP-2表达。结果与模型对照组比较，茶多酚两种给药途径的肿瘤组织VEGF、bFGF阳性表达明显降低（P0.05）；TIMP-2阳性表达明显增高（P0.05）；而心、脑、肾组织VEGF、TIMP-2阳性表达无明显差异（P0.05）。结论茶多酚可明显抑制新生血管生成相关因子表达，并特异性的作用于肿瘤靶点部位，预示在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。关键词：茶多酚；小鼠乳腺癌；VEGF；bFGF；TIMP-2；重要脏器（心、脑、肾）既往实验研究表明，茶多酚灌胃、腹腔与局部注射三种给药途径均能显著抑制S180小鼠肿瘤生长[1]，并认为降低肿瘤组织微血管密度（MDV）[2]、下调肿瘤组织血管内皮生长因子（VEGF）阳性表达与上调金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ（TIMP-2）阳性表达是其抗肿瘤机制之一[3]。我们在证实茶多酚能够抑制小鼠乳腺癌（EMT6）生长[4]，并结合茶多酚干预后对EMT6小鼠重要脏器微血管密度（MVD)研究结果，进一步检测了茶多酚干预后的EMT6小鼠肿瘤组织及其心、脑、肾组织血管生成相关因子表达，用以初步判定茶多酚抗新生血管形成的特异性与在肿瘤治疗中的应用前景。1材料1.1动物与细胞系：雌性BALB/c小鼠60只，体重(20±2)g，购自上海斯克莱实验动物有限公司[许可证号：SCXK(沪)2003-0003]，并在南京中医药大学动物中心屏障系统SPF环境下饲养。EMT6小鼠乳腺癌细胞购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心。1.2药物：茶多酚购自浙江东方茶业有限公司，纯度98％（批号：20050334）；人参皂苷Rg3（参一胶囊）每粒含人参皂苷Rg310mg，购自吉林亚泰有限公司（批号：20040704）。1.3仪器：超净工作台系苏州安泰空气技术有限公司生产（型号sa-cj-zFD）；离心机由上海安亭科学仪器厂生产（型号KA-1000）；莱卡倒置显微镜为德国莱卡公司产品（型号DMIL）；Forma恒温培养箱为美国Forma公司产品（型号3111）。1.4试剂：美国GeneTech公司生产的VEGFAb（C-1)，批号：GT300229；TIMP-2Ab-2，（批号：IM56T）以及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）Ab-FGF2（批号：BA0259）均购自博士德生物工程有限公司；免疫组化超敏鼠组织试剂盒（UltraSensitiveTMS-P）购自福州迈新生物技术开发有限公司。细胞培养与接种：EMT6细胞用含10％小牛血清的RMPI1640培养液培养，细胞长满单层后用0.25％胰酶消化，培养液吹打离心，收集细胞用PBS稀释，浓度调至5×106，每只小鼠以0.2ml接种于小鼠右后背部。12天后肿瘤长至1g时移植。2.2肿瘤移植：断颈处死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3～5min后放于超净工作台平皿中，用高压灭菌的手术器械剪开肿瘤皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤以消毒后的PBS清洗，称重，按每克肿瘤4ml溶液的比例用生理盐水稀释。剪碎瘤体，充分匀浆制成细胞悬液，浓度调至2×106，每只小鼠于右后背部皮下接种0.2ml。2.3分组及用药：接种第13天肿瘤长至1mm3时（成瘤48只），随机分为4组，即茶多酚灌胃组、茶多酚局部注射组、人参皂苷Rg3灌胃组，模型对照组。每组12只动物。所有给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。即：①茶多酚灌胃组：按人治疗量900mg/d计算，换算成实验用药中剂量为11.25mg/kg，并按小鼠体重20g计算，以2.25mg/d配置浓度5.625mg/ml，每天灌胃0.4ml。②茶多酚局部注射组：参考茶多酚腹腔注射LD50160mg/kg剂量，取其1/4量为实验用小剂量组，换算成实验用药中剂量为12mg/kg，以2.4mg/d配制浓度24mg/ml，每天局部注射0.1ml。③人参皂苷Rg3组：按人治疗肿瘤剂量40mg/d计算，换算成20g小鼠剂量为0.1mg/d，配制浓度为0.25mg/ml，每天灌胃0.4ml。④模型对照组：生理盐水灌胃，每天0.4ml。在接种第13天开始给药、给水，每日1次，连续给药10天。第11天处死小鼠，取肿瘤及心、脑、肾组织制备切片待捡。2.4血管因子检测：将肿瘤组织及心、脑、肾组织取出后迅速放置于10%福尔马林溶液中固定，第二天脱水，石蜡包埋，连续切片为4um厚，其中取一张做HE染色，其余每组选取3个组织切片，按相关试剂盒说明检测VEGF、bEGF与TIMP-2表达。用PBS作为一抗做阴性对照。染色阳性者为棕黄色，部位在内皮细胞胞浆。各组选取肿瘤组织及心、脑、肾组织各3个组织切片，每片选3个视野，用美国TN-8502图像分析系统作图像分析，测定光密度（IOD）值，取其平均值，以均数±标准差（sx±）表示。2.5统计方法：实验数据用SPSS11.5计算机统计软件进行t检验，当P0.05时表示差异有显著性，当P0.05时表示无统计意义。3结果3.1肿瘤组织血管相关因子测定：EMT6小鼠肿瘤组织VEGF、bFGF、TIMP-2测定结果见表1；组化染色图片见图1－12。表1.肿瘤组织血管相关因子测定结果IOD值（sx±）分组VEGFbFGFTIMP-2人参皂苷组106.53±29.38﹡129.01±8.21﹡100.35±18.44﹡茶多酚注射104.82±11.33﹡127.86±11.34﹡105.85±35.56﹡茶多酚灌胃121.88±15.33﹡130.26±6.57﹡109.89±20.58﹡模型对照组141.26±18.01140.38±12.3573.65±18.96注：与模型对照组比较：﹡P0.05可以看出，与模型组比较，茶多酚灌胃、局部注射以及Rg3干预后肿瘤组织的VEGF、bFGF表达明显减少，而TIMP-2明显升高，均有统计学意义（P0.05）。说明抑制肿瘤组织VEGF、bFGF表达，增加TIMP-2表达是茶多酚抑制EMT6生长机制之一。3.2重要脏器血管相关因子测定：EMT6小鼠心、脑、肾组织VEGF、TIMP-2测定结果见表2；组化染色图片见图13－24。表2(Table2).VEGF测定的IOD值(sx±)VEGFTIMP-2脏器组织模型对照组茶多酚灌胃组模型对照组茶多酚灌胃组心脏组织140.71±12.90151.30±13.30152.87±15.33160.80±11.27脑组织150.92±18.38144.39±15.01151.95±16.53163.21±14.95肾脏组织173.57±19.82164.59±12.82164.86±13.16151.76±18.76从表2可以看出，与模型对照组比较，经茶多酚干预后的EMT6小鼠心、脑、肾组织VEGF、TIMP-2无明显变化（P0.05）。这一结果可以说明茶多酚对血管因子抑制作用具有一定选择性，可明显抑制增生旺盛的肿瘤血管，而对正常血管并无明显影响。4讨论肿瘤生长和转移与瘤区血管丰富程度有密切的关系。肿瘤新生血管为肿瘤细胞生长输送营养并排泄代谢产物，转移灶形成也依赖于新生血管生成。基础实验证明，肿瘤体积超过2mm3时，都有新生血管生成。因而有效抑制血管新生，切断肿瘤血供，有望达到抑制肿瘤生及转移效果[5-6]。故抗肿瘤新生血管生成研究已成为肿瘤临床治疗领域的热点问题。目前认为，肿瘤血管生成过程可分血管内皮细胞增值、血管基底膜破坏、血管内皮细胞游走与构成血管样结构四个主要步这骤，其中也包含肿瘤细胞与正常细胞相互作用的细胞外基质、相关细胞参与以及大量细胞因子调节程度等生理、病理变化过程[7]。而抗肿瘤血管生成主要策略是针对肿瘤血管调控因子及其作用环节进行干预。抗肿瘤血管生成药物也直接或间接在于血管相关因子。血管内皮生长因子（VEGF）是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，能选择性增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖，促进血管生成，并能提高血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外基质中，从而为肿瘤细胞生长和新生毛细胞血管网的建立提供了营养条件。因此，VEGF是抗肿瘤血管生成药物作用的重要靶点部位[8]。已研制的VEGF及VEGFR单克隆抗体主要用以封闭已分泌的VEGF及VEGFR，可以阻止VEGF诱发内皮信号转导系统。如针对VEGFR的酪氨酸激酶抑制剂“SU5416”已进行Ⅲ临床试验；针对VEGF的单克隆抗体“Advastin”已试用于肿瘤临床治疗，并取得了一定的临床疗效[9]。但因价格昂贵与有严重毒副反应未能在我国广泛推广应用。在血管生成网络调控中，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）起着关键作用。bFGF能促进表皮、内皮细胞再生、血管内皮细胞分裂，并从基膜中分离出来以刺激内皮细胞向肿瘤组织趋化运动，并形成管状结构；同时，还能提高组织中血纤维蛋白溶解酶原激活因子以及能诱导内皮细胞产生其他蛋白酶，从而促进毛细血管形成[10]。基质金属蛋白酶(MMPs)在降解血管基底膜和内皮细胞的胞外基质，破坏血管结构，使内皮细胞从血管壁上脱落以形成新生血管这一关键环节中发挥作用[11]。MMPs抑制剂能够通的蛋白水解活性，能够有效的抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤转移。按照功效分类，MMP抑制剂有人工合成和天然存在的两种形式。其中，组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)为天然存在的金属蛋白酶抑制剂，所有的TIMP家族成员不仅能抑制血管生成，还可以直接遏止肿瘤细胞和内皮细胞增殖和迁移，从而抑制肿瘤生长；人工合成的肿瘤血管活性药物如batimastat(BB94)、marimastat(BB2516)等也已试用临床试验[12]。但实际疗效有待进一步评价。茶多酚是从绿茶中提取的多酚类活性物质，其不仅具有预防心脑血管疾病、抗衰老等功能效应，近些年的基础研究发现，茶多酚还具有防治肿瘤效应。对其作用机制认为与茶多酚直接杀伤肿瘤细胞、诱导细胞凋亡与诱导细胞分化、抗突变、抗转移等有密切关系[13-14]。我们在国内首次研究发现，茶多酚能够抑制肿瘤新生血管生成[2-3]。但其是否在抑制肿瘤新生血管的同时，对正常组织器官微血管具有抑制效应国内外尚未见到文献报道。为解决这一关键科学问题，在该课题研究中，除选择了茶多酚干预治疗后EMT6肿瘤组织的VEGF、bFGF、TIMP-2表达外，还检测了心、肝、肾组织的VEGF、TIMP-2表达。研究结果表明，与对照组比较，茶多酚灌胃与局部注射两种给药途径均能下调肿瘤组织VEGF、bFGF表达，上调TIMP-2表达；而心、脑、肾组织的VEGF、TIMP-2表达则无明显变化。说明茶多酚抑制肿瘤生长的重要机制是调节血管相关因子表达，并特异性的作用于肿瘤靶部位。这一重要研究结论预示茶多酚在肿瘤治疗中具有广泛的应用前景。参考文献(References)[1]徐力,侯丽,刘杰,等.茶多酚对移植性S180小鼠肿瘤模型抑瘤率的影响[J].中华中医药杂志,2005,20(12):718-720[2]万明月,叶霈智,徐力,等.茶多酚对移植性小鼠肿瘤微血管密度影响研究[J].中医药学刊2005,23(12):2162-2164[3]徐力,李冬云,侯丽,等.茶多酚干预移植性S18