分子生物学实验七

分子生物学实验实验七限制性内切酶酶切质粒DNA第3周分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍第4周从植物组织提取DNA第5周从动物组织提取DNA第7周原核细胞质粒DNA的提取第8周核酸的琼脂糖凝胶电泳第9周紫外吸收测定核酸含量第10周限制性内切酶酶切质粒DNA第11周凝胶电泳回收和纯化DNA片段第12周细菌感受态的制备第13周质粒DNA的转化第14周目的基因的PCR扩增与检测第15周原核蛋白质SDS-PAGE电泳第17周考试1、实验原理限制性内切酶或限制性核酸内切酶（RestrictionEnzymeorRestrictionEndonuclease,简称RE）是一类能够识别双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶，并在此特异位点将双链DNA切断。限制性内切酶都是从原核生物中发现的，也称细菌性酶。限制性内切酶是细菌为防范外源DNA而产生的一类酶，它可识别DNA双链上的特异性位点，以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键，并从该点将DNA分子切断，产生DNA片段的5为P，3为OH,而宿主内的DNA则因它的一些特异性位点常常由于其中的一个碱基的甲基化被保护起来,使此位点不再成为限制酶的底物。限制性内切酶是基因工程技术中不可缺少的工具，也称为工具酶。限制性内切酶的高度特异性与反应条件有关。每种酶都要求最适合的反应条件，如缓冲液和甘油浓度等，当这些条件改变时，某些酶的识别序列将改变。限制性内切酶多保存在甘油之中，商品酶制剂一般含有50%的甘油，它起着稳定酶活性的作用。而在酶反应体系中，甘油量太大会抑制酶的活性。为此，要求一般酶甘油制剂的使用量应小于反应体系体积的10%。例如反应体积为20l时，使用的酶制剂不可大于2l。一般限制性内切酶的反应缓冲液要求有三种基本物质：Tris-Hcl（pH7.5）、MgCl2和NaCl。不同酶需要这三种物质在缓冲液中的浓度各不相同。DTT（二硫苏代糖）或用-巯基乙醇，主要起保护酶活性的作用。反应体系中限制性内切酶的用量与如下两方面有关系：（1）DNA的分子量：酶切相同重量的DNA，分子量大的，分子数就少，所以使用的酶量就少些，因而酶用量与DNA的分子量成反比。（2）酶切位点的多少：在DNA分子中切口多的酶，因每个切口都需要酶作用，因而酶的用量就相对多些，切口少的酶则用量就相对少些，所以酶用量与DNA分子上的切口数成正比。2、限制性内切酶消化质粒DNA的反应本实验用BamHI和HindIII酶“切割”质粒pMD18-T-kfNHX。已知pMD18-T-kfNHX质粒上只1个BamHI和HindIII酶切口，kfNHX的碱基序列长为约1700bp,被酶切后，出现两条带在琼脂糖凝胶电泳图谱中可以观察到。3、材料与仪器3.1质粒：根据具体情况而定；3.2限制性核酸内切酶BamHI和HindIII；3.3微量加样器；3.4EP管；3.5水浴锅或37C培养箱；3.6电泳设备；3.7凝胶成像系统4、试剂与配制20ul反应体系：10×Kbuffer2μl，BamHI0.5μl，HindIII0.5μl,sample:根据质粒样品的浓度加8μl，加水补足20μl37C反应3-4小时。0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，照相贮存5、思考题：1.影响酶切结果的主要因素有哪些，请正确分析你的实验结果。2.限制性内切酶可用于分子生物学的哪些方面？图1.ＲＴ-ＰＣＲ扩增产物的凝胶电泳图谱Fig.1AmplificationofKfNHXbyRT-PCRfromKalidiumfoliatumcDNA1:DL2000+15000marker2:KfNHX