分子生物学第二章DNA结构与复制

2.2DNA的结构核酸的结构及其功能DNA-遗传的物质基础，基因是具有特定生物功能的核苷酸序列，基因通过转录和翻译能够使亲代的性状准确地在子代表现出来。DNA的此种功能与其分子结构是密切相关。2.2.1DNA的一级结构1.DNA的化学成分2.DNA和RNA化学成分的比较3.核苷酸的结构4.DNA的一级结构（1）DNA一级结构的表示法（2）DNA碱基组成的Chargaff规则（1949）（3）DNA和RNA一级结构的比较2.2.2DNA的二级结构DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。在DNA二级结构与高级结构间或高级结构的各种构象间存在一个动力学平衡。Z-DNA调控基因转录的两个模式DNA的双螺旋结构的意义该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。2.3DNA的复制研究证明生命的遗传实际上是染色体DNA自我复制的结果。而DNA自我复制主要是通过半保留复制来实现的，是一个以亲代DNA分子为模板合成子代DNA链的过程。即细胞分裂时，通过DNA自我复制将亲代细胞所含有遗传信息传递到子代细胞。双链DNA的复制包括复制的起始、延伸和终止三个阶段，并需要拓扑异构酶、解链酶、单链结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及DNA连接酶等酶和蛋白质的参与。2.3.1DNA的半保留复制Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型的同时对其复制过程进行了探讨。DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。新合成2条DNA链的核苷酸序列和亲代DNA链完全相同。因此，每子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，DNA这种复制方式叫做DNA的半保留复制。氯化铯密度梯度离心法：由于15N-DNA分子的密度比普通DNA的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，这两种DNA分子形成位置不同的区带。结果证实：无论原核还是真核生物DNA都是以半保留复制方式遗传的2.3.2复制的起点、方向和速度DNA复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，这个复制起始点呈现叉子的形式，被称为复制叉。DNA的复制是由固定的起始位点开始的。复制子是生物体DNA复制的基本单位，一个复制子只含一个复制起始位点。复制叉从复制起点开始沿着DNA链连续移动，起始点可以启动单向复制或者双向复制，这主要取决于在复制起点形成一个还是两个复制叉。复制起始点的特点1.富含AT：测定细菌、酵母、线粒体和叶绿体DNA中的复制起始点核苷酸序列，发现复制起始点富含AT序列，它可能有利于DNA复制启动时双链的解开。2.细菌、病毒和线粒体DNA分子只有一个复制起始点，即只有一个复制子。3.真生物基因组DNA有多个复制起点，可以同时在多个复制起点上进行双向复制，其大小为40-100kb/个。复制叉移动方向放射性自显影法：对于大基因组内的不确定区域，两次连续的放射脉冲可以用来标记复制的移动。如果一个脉冲比另一个脉冲强，我们可以用相对的标记强度来区分，这些可用放射自显影观察。单向复制：在复制眼的一端，一种类型的标记后紧跟着另一种标记；双向复制：在复制眼的两端产生一种（对称的）模式。在真核生物中普遍存在。DNA链复制过程示意图2.2.3DNA复制的几种主要方式生物体内DNA双链的复制大都是以半保留方式进行的；但是不同生物DNA分子存在形式各不相同，如大小、线性分子、环状分子、功能差异，因而反映在复制方式上的差异。绝大多数DNA复制是以复制叉的形式进行的。线性DNA双链的复制研究表明DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5`端向3`端移动；体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后RNA引物被切除，使子链短于母链。切除后的5`端缺口如何合成？这就提出了线性DNA末端复制的问题。寿命缩短？线性DNA末端复制的特殊机制（1）线性复制子转变为环状或多聚分子：T4噬菌体DNA通过其末端的简并性使不同链的3端因互补而结合。DNA聚合酶作用填满其缺口，再经DNA连接酶作用生成二联体。（2）DNA末端形成发夹式结构，是该分子没有游离的末端。如草履虫线粒体DNA。（3）某种蛋白启动复制腺病毒DNA分别在分子两端启动复制，并通过链取代法使之延伸。末端蛋白的作用下，在真正的末端上启动复制。（1）θ-复制（2）滚环复制（3）D-环复制2.环状DNA的复制（1）θ-复制E.coli基因组的复制原点位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操纵子之间，全长=45bp，称为oriC。OriC富含AT，并含有多个短的重复序列，能够被复制起始点结合蛋白所识别。复制的起始：涉及DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉。前导链还是复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短的RNA链，作为起始DNA复制的引物。（2）滚环复制（replicationbyrollingcyclesstructure）这是单向复制的一种特殊形式。φX174噬菌体由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负（-）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。(3)D-环型（D-loop）：这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环（即D-环）。2.4DNA复制的特点2.4.1原核生物E.coliDNA复制的特点基因组DNA是双链环状；复制起始区位于其遗传图的84min附近；OriC含有3个13bp和4个9bp的两个保守序列。复制起始后形成的两个复制叉沿着整个基因组双向等速移动，DNA复制中间产物呈一个θ。1.DNA双螺旋的解旋研究证实多种蛋白质及酶参与DNA双链的解开过程。如拓扑异构酶I、DNA解链酶及SSB蛋白等。（1）DNA解链酶DNAhelicase是经水解ATP获得能量来解开双链DNA，大部分DNAhelicase沿着随后链模板5′→3′方向及沿着复制叉的前进而移动。研究证明：Rep蛋白和特定的DNA解链酶分别在DNA两条链上协调作用，以解开双链DNA。（2）单链结合蛋白(SSB蛋白）发现噬菌体T4的基因32蛋白可以在远低于解链温度时使双链DNA分开，并牢牢地结合在单链DNA上，后来发现许多生物中都有这类蛋白。原核生物：SSB蛋白与DNA结合时还表现协同效应，如第1个SSB蛋白结合DNA的能力为1，第2个SSB蛋白的结合力可达103。真核生物SSB蛋白与单链DNA结合时，不表现协同效应。SSB蛋白:保证被解链酶解开的ssDNA在复制完成之前能保持单链结构，SSB蛋白以四聚体形式存在于复制叉处，他没有解链作用。（3）DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）DNA复制过程中，随着DNA解旋，双螺旋的盘绕数T减少，而超螺旋数W增加，使正超螺旋增加，未解链部分的缠绕更加紧密，形成的压力使解链不能继续进行。DNA拓扑异构酶作用它能够消除解链造成的正超螺旋堆积，消除阻碍解链继续进行的此种压力，使DNA复制得以延伸。2.DNA复制的引发研究发现：①所有DNA复制是由一个固定的起始位点开始；②DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链。问题：一个新链DNA的复制怎样开始的呢？研究发现：所有DNA聚合酶都从脱氧核苷酸3‘-OH端起始DNA合成，所以，DNA复制时，由引发酶(特殊RNA聚合酶)在DNA模板上合成一段RNA链，它提供引发末端（引物），接着由DNA聚合酶从RNA引物的3’-OH端开始合成新的DNA链。无论前导链还是后随链开始DNA合成时，都需要RNA引物。参与DNA复制的蛋白质：后随链的引发由引发体来完成。引发体由n，nˊ，n〞，DnaB、C和I等6种蛋白质共同组成。DnaA：结合Ori区，具ATP酶活性，促进DnaB形成起始复合物DnaB：DNA解链酶，有解旋和解链作用DnaC：形成起始复合物，运输DnaBDnaG：DNA引发酶由dnaG基因编码，在特定环境下发挥作用的RNA聚合酶Hu：促进起始复合物形成回旋酶：松驰正超螺旋，促进单链DAN产生SSB：促进DNA解链，稳定单链DNA性3.冈崎片段与半不连续复制dsDNA两条链是反向平行的，因此在复制叉附近的DNA链一条是5’→3，另一条是3’→5’，即两条模板极性不同。而DNA聚合酶：DNA合成方向是5’→3，而不是3’→5’。无法解释DNA两条链是如何能够同时进行复制？日本科学家Okazaki通过含3H-dTTP培养基培养大肠菌标记其DNA，提出DNA的半不连续复制模型。原核生物冈崎片段〉真核生物冈崎片段Okazakifragment：1000~2000b。冈崎片段与DNA的半不连续复制模型前导链连续复制，而后随链不连续复制。4.复制的终止Tus蛋白参与DNA复制的终止，而不需要太多蛋白质的参与。终止子序列由22个碱基的重复序列的Ter组成。当复制叉迁移到Ter时，Ter-Tus复合物能使DnaB不能再将DNA解链，阻挡复制叉的继续迁移，而为复制的50-100bp经修复方式填补。拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。5.DNA聚合酶(1)大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能Klenow片段:ThisenzymeispurifiedfromE.colicellsinwhichthe3′-endtwo-thirdsoftheE.coliDNApolymeraseIgeneiscloned.Thus,ithas3′→5′exonucleaseactivity,butnot5′→3′exonucleaseactivity.68kD35kDDNA聚合酶Ⅱ其有5′→3′聚合酶活性，但活性低，其酶活性是DNA聚合酶Ⅰ的5%。通过其3′→5′核酸外切酶活性可起校正作用。DNA聚合酶Ⅲ其有5′→3′聚合酶活性，3′→5′核酸外切酶活性。该酶活性为DNA聚合酶Ⅰ的15倍，DNA聚合酶Ⅱ的300倍。即5万个核苷酸/min速度合成新DNA链。其他DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ分别由dinB和umuD’2C基因编码，主要在SOS修复过程中发挥作用。2.4.2真核生物DNA复制的特点（1）DNA分子上出现多复制起始位点；（2）真核生物染色体在全部完成复制前，各个起始点上DNA复制不能再开始；（3）真核生物DNA复制只在其细胞周期S期进行；（4）真核生物复制子大小约为40~100kb。真核生物DNA复合起始区特点：酵母复制起始区长度约为150bp，包括数个复制起始必须的保守区，将克隆该DNA片段构建环状DNA分子，它在酵母中自主复制的。酵母复制起始位点成为自主复制序列(autonomouslyreplicatingsequences,ARS）。不同ARS共同特征是具有一个11个A-T碱基对的保守序列。ORC（originrecognitioncomplex）识别并结合ARS序列，ORC有6种蛋白组成的起动复合物。人类基因组DNA上每隔30000~300000bp序列有一个复制起始位点。真核生物DNA复制叉的移动速度为50bp/sec，E.coli的1/20。真核生物DNA聚合酶哺乳动物主要有5种DNA聚合酶，其特性见表2-12.2.4.3DNA复制的调控1.大肠杆菌基因组DNA的复制调控原核细胞的生长和增殖速度取决于培养条件，但在生长增殖速度不同的细胞中DNA链延伸的速度几乎是恒定的，只是复制叉的数量不同。细胞内复制叉的多少决定了复制起始频率的高低，这可能是原核细胞复制的调控机制。复制起始频率的直接调控因子是蛋白质和RNA。大肠杆菌染色体DNA复制调控染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但复制与细胞分裂不直接耦联。复制起始不依赖于细胞分裂，而复制的终止则能引发细胞分裂。复制子与转录的操纵子相似，由起始物位点和复制起点两部分组成。起始物位点编码复制调节蛋白质，复制起点与调节蛋白质相互作用并启动复制。起始物位点突变使复制停止并导致细胞死亡。大肠杆菌的复制起点有