第6章食品工业中应用的酶酯酶多酚

第6章食品工业中应用的酶6.3.1酯酶的定义、来源及分类R－O－R’＋H2OR－H＋R’－OH酯酸醇甘油三酯＋H2O甘油二酯（或甘油一酯脂或甘油）＋脂肪酸酯酶和脂酶同义吗？？酶？酶6.3酯酶酯酶（esterase）•是催化酯类中酯键裂解的酶类，反应可逆。•水解时，产物为酸和醇类；合成时，把酸的羟基与醇的醇羟基缩合并脱水，产物为酯类及其它香味物质。R－O－R’＋H2OR－O－H＋R’－OH酯酸醇脂酶(Lipase，EC3.1.1.3)•又叫甘油酯水解酶、脂酶，是酯酶中的一类，催化甘油三酯水解生成甘油二酯或甘油一酯或甘油。酯酶分布和来源•酯酶广泛分布于植物、动物和微生物中•动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。主要是真菌，12属233种。其次是细菌。•酯酶作为生物催化剂已经实现商品化，在食品、医药、化工等领域起着越来越重要的作用。•羧酸酯水解酶、脂肪酶、磷酸酯水解酶应用最广羧基酯类（E.C.3.1.1）磷酸单酯（E.C.3.1.3）磷酸二酯（E.C.3.1.4）三磷酸单酯（E.C.3.1.5）硫酸酯（E.C.3.1.6）硫酯（E.C.3.1.6）动物源性酯酶反应性质类酯酶的分类（E.C.3.1）来源分类植物源性酯酶微生物源性酯酶对有机磷化合物作用A类B类C类非特异性酶•如羧酸酯水解酶作为以脂肪族和芳香族醇的羧酸酯为底物的酶可以作用于乙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三丁酸酯、乙酸苯酯；•再如，乙酸酯水解酶是以乙酸酯为底物的酶可以作用于乙酸乙酯和乙酸苯酯。•另外，依据酶对底物的特性，分为非特异性和特异性总称本酯水解酶。特异性酯酶•分为醇特异性和酸特异性•醇可以是一元醇或多元醇、脂肪族醇或芳香族醇；•酸可以是有机酸或无机酸。如羧酸酯水解酶中有磷脂酶、叶绿素酶、乙酰胆碱酯酶、果胶酯酶等。6.3.2.1酯化作用中酯酶的催化特性•非极性溶剂适合于酯化合成，控制酯化系统中的水含量，有利于向合成方向进行，同时，维持微量的水也是促进酶活性的条件之一，在绝对无水的条件下合成反应一般也无法进行。•及时移出反应产物可促进酯化反应继续进行。6.3.2酯酶的催化特性6.3.2.2脂酶的催化特性•脂酶的天然底物是不溶于水的，脂酶作为水解酶能作用于乳化的脂肪球，脂肪和水之间的界面是酶作用的部位。100ml甘油三油酸酯乳状液中界面面积105㎝2胰脂酶作用于不溶解的甘油三酯时，酶活力和乳化液界面面积的关系B－甘油三丁酯O－甘油三油酸酯酶反应速度是酶—底物络合物浓度的函数•在脂酶反应体系中，酶－底物络合物的生成是由于酶吸附在底物与溶剂之间的界面上的结果，而不是由于酶分子结合底物的结果。•随着界面面积增加，更多的脂酶分子离开水相，开始裂开界面上的甘油三酯。当界面面积大到足以容纳所有的脂酶分子时，它的进一步增加将不会再影响脂酶的活力。脂酶的催化反应条件•脂酶的催化反应最适pH和最适温度随底物、脂酶的纯度、缓冲液和测定的方法不同而稍有改变。•虽然大多数脂酶的最适pH在碱性范围，即pH8～9，但是也有一些脂酶具有酸性的最适pH，如胰脂酶的最适pH为8～9。然而，由于底物、盐和乳化剂的影响，它的最适pH甚至可以下降到6～7。不同的微生物脂酶的最适pH存在着很大的差异，它们的范围为5.6～8.5。盐对脂酶作用有影响•胆酸盐等具有乳化作用的盐能增强脂酶的活力。•重金属的盐类确切无疑地抑制脂酶的活力。•氯化钠对猪胰脂酶的作用是必需的。当NaCl的浓度增加到7mmol/L时，酶的活力达到最高值，超过这个浓度，酶的活力开始下降。•钙离子能激活大多数脂酶的作用，并且能增强胰脂酶的热稳定性。6.3.2.3磷脂酶的催化特性•酶A1水解1位健、酶A2水解2位健、酶C水解3位健、酶D水解4位健。6.4多酚氧化酶•多酚氧化酶（邻——二酚：氧氧化还原酶；E1,10,3,1）在植物界乃至动物界分布广泛，由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。引起食品酶促褐变的主要酶类•果蔬食品在加工及贮藏过程中存在褐变反应，而褐变的原因有非酶性的和酶性的，多酚氧化酶是引起食品酶促褐变的主要酶类，因此研究多酚氧化酶的特性对制定食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。•有害：新鲜、冷冻、干制和罐藏产品的褐变。•有利：红茶生产，黑葡萄干生产等•三要素：底物、O2、酶6.4.1多酚氧化酶在自然界的分布•（1）广泛存在于自然界，植物、微生物及动物器官。植物品种不同，含量变化很大。果蔬中以橄榄含量最高。•（2）PPO在植物细胞中分布取决于品种和年龄，果蔬而言还取决成熟度，如马铃薯，芽根﹥幼叶﹥成熟叶、茎叶。•（3）PPO在果蔬的不同部分含量存在很大差异。大多数水果中PPO以结合状态存在。葡萄皮中PPO活力高，葡萄成熟时PPO活力下降幅度最大。6.4.2PPO催化的反应及其作用底物•6.4.2.1催化反应：两类反应都需要有分子氧参加(1)一元酚羟基化：蘑菇中单酚。(2)邻二酚氧化，生成邻苯醌。多酚氧化酶催化的氧化反应的最初产物邻－醌将继续变①相互作用生成高分子量聚合物。②与氨基酸或蛋白质作用生成高分子络合物。③氧化其氧化－还原电位较低的化合物，生成无色化合物——其中①②导致褐色素的生成，反应③的产物是无色的6.4.2.2作用底物（1）果蔬中四类①儿茶素②3,4－二羟基肉桂酸酯③3,4－二羟基苯丙氨酸④酪氨酸（2）特点①PPO的最佳底物并非和酶同时存在于同一植物中。②PPO只能催化在对位上有一个大于－CH3的取代基的一元酚羟基化，即PPO对底物具有特异性要求。③不同的品种果蔬，同一品种不同部位中PPO具有不同的底物特性。④PPO在植株幼嫩阶段及生长旺盛期活性最高。6.4.3pH对多酚氧化酶活力的影响分析P135表6-13，可得出哪些结论？PPO的最适pH4-7之间波动。不同种类、不同品种、同一果蔬的不同部位，pH也有差异。酶的提取或分离方法对最适pH也有影响。测定酶活力时，采用的底物和缓冲液对酶最适pH有影响。有些情况下，PPO具有一个最适pH外，尚有第二个最适pH。6.4.4温度对多酚氧化酶活力的影响①酶活力最适温度逐步提高降低，如桃中PPO，从3℃开始随温度升高，至37℃最高，后下降。②不同底物表现出不同的PPO酶活力最适温度：如马铃薯，底物为儿茶素，最适温度22℃；底物为焦醅酚，最适温度15－35℃，线性上升。③热失活温度70-90℃/短时间。④低温状态酶失活是可逆的。微量的多酚氧化酶也能导致果蔬褐变，冷冻食品生产中热处理是必要的。6.4.5多酚氧化酶抑制效应酶促褐变三因素：酶，底物，O2。为什么柑桔榨汁后不易发生褐变？（1）对酶的抑制：•PPO以铜为辅基的金属蛋白，金属螯合物，如抗坏血酸、柠檬酸、EDTA、果胶、氰化物。（2）与酶催化生成的反应产物作用①同邻二酚氧化产物醌作用的还原剂，如抗坏血酸、SO2、偏重亚硫酸盐。②醌偶合剂：与醌作用，生成稳定的无色化合物，如半胱氨酸、谷胱甘肽、SO2、偏重亚硫酸盐。（3）清除酶作用的底物•与酚类底物作用的化合物：–PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）与酚强烈缔合，消去底物。（无甲醛啤酒的生产）•隔氧（4）热烫处理（灭酶）6.4.6光照强度与多酚氧化酶活性多酚氧化酶属于植物体内的末端氧化酶系统，光照明显促进了此酶的活性。不同光照条件下海带体内酚类化合物含量的结果表明，在0－1200Lx(勒克斯)间，PPO随光照强度增加而呈上升趋势。在对玫瑰组织培养的研究中，采用不同的遮光处理(对照、单层膜、双层膜)，其结果也同样证明在一定的光照强度变化幅度内，PPO活性和接种后的褐变率均随光强增加而上升。6.4.7多酚氧化酶的激活剂•多酚氧化酶的作用会导致食品褐变。长期以来，防止食品的酶促褐变是一个重要的研究课题。食品界在多酚氧化酶的抑制剂方面作了很多的研究工作，而对于它的激活剂相对地了解较少。•阴离子洗涤剂，例如SDS(十二烷基磺酸钠)，能有效激活多酚氧化酶。若苹果经PVP(聚乙烯毗咯烷酮)处理，其果皮的多酚氧化酶便会失活，但用SDS处理后又能将已失活的酶激活。SDS能激活以潜在的形式存在于粗提取液中的多酚氧化酶。•若用酸或尿素短时间地处理葡萄中的多酚氧化酶，能使酶可逆地激活；如果用酸处理作用时间较长，会导致酶不可逆地激活。•另外Cu2+和底物3，4－二羟基苯丙氨酸对一些果蔬来源的多酚氧化酶也有激活作用。6.5葡萄糖氧化酶（GOD）GlucoseOxidase，简称GOD，β-D-葡萄糖：氧氧化还原酶；EC1.1.3.4）是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖成为葡萄糖酸内酯和过氧化氢。•葡萄糖氧化酶的催化反应：+O2→+H2O2OHOHHHHHOHOHOHOHEFADOOHHHHHOHOHOHO+EFADH2O2EFAD+H2O2H2OOHOHOHHHHHCOOHOHOHOHHδ-D-葡萄糖酸内酯D-葡萄糖酸•1928年由Muller首先从黑曲霉（Aspergillusniger）的无细胞提取液中发现葡萄糖氧化酶。随后Kusai等、Pazur和Swobod-da等分别从青霉素（P.Variable）和黑曲霉中提纯葡萄糖氧化酶。其他霉菌，像米曲霉和点青霉也能产生葡萄糖氧化酶，然而在高等植物和动物体内还没有发现葡萄糖氧化酶。•葡萄糖氧化酶现已从多种材料中提取纯化予以结晶，并广泛应用于食品、医药、临床化学和分析化学等许多领域中。6.5.1葡萄糖氧化酶的催化特异性•葡萄糖氧化酶与其他大多数酶一样，特异性非常严格。它对β-D-吡喃葡萄糖表现出高度的专一性。葡萄糖氧化酶底物分子C（1）上的羟基在酶的催化作用中起到重要作用，且羟基处在β-位时酶的活力比处在α-位时高约160倍。底物分子中的任何一点改变都会显著降低其氧化速率。OHOHHHHHOHOHOHOHEFADOOHHHHHOHOHOHO+EFADH2O2EFAD+H2O2H2OOHOHOHHHHHCOOHOHOHOHHδ-D-葡萄糖酸内酯D-葡萄糖酸表7-14葡萄糖氧化酶的底物特异性葡萄糖改性的位置化合物同β-D-葡萄糖的差别相对速率β-D-葡萄糖1001α-D-葡萄糖C（1）上OH的构型0.6411,5-脱水-D-葡萄糖醇C（1）上OH被H取代022-脱氧-D-葡萄糖C（2）上OH被H取代3.32D-甘露糖C（2）上OH的构型0.9822-O-甲基-D-葡萄糖C（2）上OH的H被甲基取代033-脱氧-D-葡萄糖C（3）上OH被H取代14D-半乳糖C（4）上OH的构型0.544-脱氧-D-葡萄糖C（4）上OH被H取代255-脱氧-D-葡萄糖C（5）上OH被H取代0.055L-葡萄糖C（5）上CH2OH的构型066-脱氧-D-葡萄糖C（6）上OH被H取代06木糖C（6）被H取代0.986.5.2葡萄糖氧化酶的分子组成及其作用机制•葡萄糖氧化酶以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基，每克分子酶含2克分子FAD，来源不同，其分子量亦有所差别。•目前葡萄糖氧化酶的工业酶制剂主要来源于黑曲霉，因此黑曲霉葡萄糖氧化酶是这类酶中研究得最为彻底的一种。黑曲霉葡萄糖氧化酶分子量为16万左右。•实验数据证明，葡萄糖氧化酶催化的反应的速度同时取决于O2和葡萄糖的浓度，反应遵循乒乓机制，可以用下面的图表来表示：p141图6-7•图中G和L分别代表β-D-葡萄糖和δ-D-葡萄糖酸内酯•也可以用下式描述葡萄糖氧化酶催化的反应：OHOHHHHHOHOHOHOHEFADOOHHHHHOHOHOHO+EFADH2O2EFAD+H2O2H2OOHOHOHHHHHCOOHOHOHOHHδ-D-葡萄糖酸内酯D-葡萄糖酸•反应中，氧化态酶EFAD作为脱氢酶从β-D-葡萄糖分子中取走两个氢原子形成还原态酶EFADH2和δ-D-葡萄糖酸内酯，随后δ-D-葡萄糖酸内酯非酶水解成D-葡萄糖酸，同时还原态葡萄糖氧化酶被分子氧再氧化成氧化态葡萄糖氧化酶。如果反应体系中存在过氧化氢酶，那么H2O2被催化分解成H2O和O2。6.5.3pH对葡萄糖氧化酶作用的影响•葡萄糖氧化酶的最适pH值为5.6，在pH3.5～pH6.5之间保持良好的稳定性。结晶酶在pH3.5～7.6，40℃下稳定。没有保护剂存在的